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本试验以白藜芦醇、乳房链球菌 0140J(Streptococcus uberis 0140J,S.uberis 0140J)为研究对象,通过构建小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)及C57BL/6小鼠感染模型,探究白藜芦醇对乳房链球菌感染引起氧化应激的影响及机制。研究通过观察氧化损伤相关指标及信号通路中相关蛋白和酶的变化,从体内、外两方面阐明白藜芦醇如何缓解乳房链球菌感染诱发氧化损伤,目的是为乳房链球菌及其它类似病原菌的防控提供新的思路和方法。具体研究内容及结果如下:1.白藜芦醇对乳房链球菌感染引起的乳腺上皮细胞氧化应激的影响为了探究白藜芦醇对乳房链球菌感染引起氧化应激的影响,研究以小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)为研究对象,通过显微镜、试剂盒(比色法、微量法、可见分光光度计法等)、流式细胞术等仪器/方法对相关指标进行观察或测定。结果表明:白藜芦醇处理EpH4-Ev细胞的安全浓度范围为0-20 μmol·L-1,调控S.uberis感染EpH4-Ev细胞的最佳浓度及时间为15 μmol·L-1与4 h。与对照组相比,S.uberis感染可以显著提高EpH4-Ev细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,一氧化氮(nitric oxide,NO)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)与丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性(P<0.05),显著降低总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的水平(P<0.05),并引起EpH4-Ev细胞发生皱缩。白藜芦醇预处理后可显著降低S.uberis感染后EpH4-Ev细胞中ROS的水平,NO与MDA的含量,iNOS、NAGase与LDH的活性(P<0.05),显著提高T-AOC的水平、SOD的活性及GSH的含量(P<0.05),对感染引起的细胞皱缩现象有明显改善作用。结果表明,15 μmol·L-1的白藜芦醇预处理4 h可以显著缓解乳房链球菌感染引起乳腺上皮细胞的氧化损伤。2.白藜芦醇激活Nrf2信号通路缓解乳房链球菌感染引起的乳腺上皮细胞的氧化应激为了探究白藜芦醇缓解乳房链球菌感染引起氧化应激的机制,用15 μmol·L-1白藜芦醇处理细胞4 h,之后,加入S.uberis共孵育3 h,收集样品(适时用抑制剂ML385抑制Nrf2的表达及用靶向p62的siRNA干扰p62的基因表达)。用Western blot、RT-PCR、试剂盒等方法对相关指标进行测定。结果表明:S.uberis感染显著提高了 EpH4-Ev 细胞中核转录因子 2 相关因子 2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶 1(hemeoxygenase-1,HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)、SOD1、p62 的蛋白表达水平,Nrf2、HO-1、NQO1、谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,G5T)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、p62的mRNA表达水平亦显著升高(P<0.05),而Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap 1)的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。白藜芦醇预处理进一步提高了 EpH4-Ev细胞中Nrf2、HO-1、SOD1、p62的蛋白表达水平(P<0.05),NQO1蛋白表达水平呈现升高的趋势,同时显著提高了Nrf2、HO-1、NQO1、GST、CAT、p62的mRNA表达水平(P<0.05),但是显著降低了 Keap1的蛋白表达水平(P<0.05)。使用Nrf2抑制剂(ML385)处理后,S.uberis感染及白藜芦醇预处理对EpH4-Ev细胞中HO-1、NQO1、SOD1的蛋白表达水平具有降低的作用;GSH含量与SOD的活性也显著下降(P<0.05);同时发现,上述处理显著降低了CAT、HO-1、NQO1、GST的mRNA表达水平(P<0.05);而对Keap1与p62的蛋白表达水平具有升高的作用(P<0.05);LDH的活性和MDA的含量也显著升高(P<0.05)。与对照组相比,使用sip62显著降低了S.uberis感染和白藜芦醇预处理后EpH4-Ev细胞中Nrf2和NQO1的蛋白表达水平(P<0.05),而显著升高了 Keap1的蛋白表达水平(P<0.05)。结果表明白藜芦醇可以通过介导p62调控Keap1/Nrf2信号通路,激活下游抗氧化相关蛋白的表达,缓解乳房链球菌感染小鼠乳腺上皮细胞引起的氧化损伤。3.白藜芦醇对乳房链球菌诱发小鼠乳腺炎症的影响及机制为了探究白藜芦醇对乳房链球菌诱发小鼠乳腺炎症的影响及机制,本试验以C57BL/6小鼠为研究对象,在小鼠确认怀孕14天起,每天灌胃50 mg·kg-1的白藜芦醇或相应体积的无菌生理盐水,直到产前。雌鼠分娩后48 h,用乳腺导管针灌注S uberis(S uberis、Resveratrol+S uberis组)或相应体积的无菌生理盐水(Control、Resveratrol组),之后24h收集乳腺组织和血浆样品进行相关指标测定。试验结果表明:灌注S.uberis可以诱发乳腺组织严重的炎症反应;组织中载菌量没有显著差异而NAGase活性和MDA含量显著升高(P<0.05);乳腺组织中p62与HO-1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);此外,在血浆样品中,MDA含量显著升高,T-AOC水平显著降低(P<0.05)。白藜芦醇预处理可以缓解S uberis感染后乳腺组织的炎症反应,同时显著降低由S.uberis感染引起的乳腺组织中NAGase活性和MDA含量的升高(P<0.05);在基因水平上,乳腺组织中p62、Nrf2、HO-1、GST的表达水平显著升高(P<0.05),NQO1与CAT呈现升高的趋势;在蛋白水平上,上述处理对乳腺组织中Nrf2、NQO1及HO-1的表达水平有升高的作用;此外发现,血浆中T-AOC水平显著升高而MDA含量显著降低(P<0.05)。以上结果表明,C57BL/6小鼠灌胃白藜芦醇,可以通过激活p62、Nrf2及下游信号通路,缓解乳房链球菌感染引起乳腺组织的氧化损伤。综上所述,白藜芦醇通过激活p62介导Keap1降解,诱导Nrf2及下游抗氧化信号通路的表达,缓解乳房链球菌感染引起的氧化损伤。研究的开展为多酚类化合物白藜芦醇用于奶牛乳腺炎的防控提供了理论依据。