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膀胱癌是常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之,在我国,其发生率高于前列腺癌和肾癌。移形细胞癌是最常见的膀胱癌病理类型，占全部膀胱肿瘤的90%以上。膀胱癌的发病与老龄化、环境污染、吸烟，以及职业性接触等有关，全世界膀胱癌的发病率呈上升趋势。膀胱癌具有高复发性和低致死性，是世界上治疗成本最高的癌症之。膀胱癌的发生主要涉及两条分子通路的异常，它们大致构成了两种病理类型各异、预后显著不同的肿瘤亚型。但仍有许多其他基因参与了其发生和进展，两种类型之间还存在着定的重叠。因此，深入研究膀胱癌发生发展的分子通路和相关基因异常，阐明其发病机理、寻找新的肿瘤标志物及治疗手段仍然是膀胱肿瘤研究的热点课题。近年来microRNA在肿瘤中的表达和功能受到关注。而Dicer是种III型RNA酶家族的核酸内切酶，是催化microRNA成熟和执行功能的关键蛋白。遗传学研究显示Dicer在哺乳动物的发育中具有关键作用，Dicer缺失小鼠在胚胎期死亡，而敲除Dicer基因的小鼠胚胎干细胞可以存活，尽管它们完全丧失了产生microRNA的能力，并在体内和体外显示出显著的分化障碍。这些提示microRNA通路对细胞增殖和分化具有关键性作用。最近，Dicer在肿瘤中的表达及功能研究也受到重视。在多种人类肿瘤中发现Dicer基因表达异常。在许多肿瘤中还报道了Dicer下调和肿瘤侵袭性表型的相关性。但Dicer在膀胱癌中的表达和作用尚不明确。本课题旨在探究膀胱癌中Dicer的表达和作用，以明确膀胱癌发生，进展的分子机理，为膀胱癌的诊断和治疗提供新的思路和靶点。第一部分Dicer在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义目的：探讨Dicer基因在膀胱癌组织中的表达情况及其与临床病理参数和患者预后的相关性。方法：应用半定量RT-PCR法检测20对膀胱癌组织和癌旁组织以及7例正常膀胱粘膜中Dicer基因mRNA的表达情况。以免疫组织化学法检测膀胱癌组织，癌旁组织和正常膀胱粘膜中Dicer蛋白的表达情况。在36例非肌层浸润性膀胱癌组织中应用免疫组化法检测Dicer蛋白表达水平，通过随访患者了解疾病复发情况，应用生存分析法和cox回归模型建立Dicer水平和复发间的相关性。结果：Dicer基因mRNA和蛋白在膀胱癌组织中表达水平低于癌旁组织和正常膀胱粘膜（P <0.05）。但在不同分期和分级的膀胱癌组织间，Dicer水平无显著性差异。生存分析发现本组膀胱肿瘤电切术后中位无复发生存期为19.5月（17.0~22.0），其中Dicer高表达组的中位无复发生存期为21.8月（19.4~24.1），而Dicer低表达组中位无复发生存期为13.9个月（9.7~18.0），P <0.05。Cox回归模型显示，Dicer表达水平是非肌层浸润性膀胱癌术后复发的独立危险因素，HR=4.2（95%CI：1.4~12.3）。结论：Dicer在膀胱癌组织中低表达，较低的Dicer表达水平与术后早期复发相关。第二部分膀胱癌细胞系T24中抑制Dicer表达对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响目的：研究膀胱癌细胞系T24中敲减Dicer对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法：应用siRNA敲减T24细胞系中Dicer表达。以MTT法检测细胞增殖，以PI-Annexin V双染色流式细胞术检测细胞凋亡。以Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。结果：共设计了3条针对Dicer的siRNA，其中siRNA-2可以有效地抑制T24细胞中Dicer的表达。在T24细胞中敲减Dicer后96小时出现增殖抑制效应并持续至120小时。在转染siRNA后48小时检测细胞凋亡发现敲减Dicer后T24细胞凋亡比例增加。Transwell实验可以观察到细胞迁移和侵袭能力均增加。结论：T24细胞中敲减Dicer表达对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力均产生影响，较低的Dicer表达水平可以抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，但可诱导细胞迁移和侵袭能力的增加，然而其中的确切机制还有待进步研究。第三部分膀胱肿瘤细胞系T24中microRNA-18a靶向抑制Dicer表达并抑制细胞增殖目的：探讨microRNA-18a对Dicer的转录后调控作用，及其对T24细胞增殖的影响。方法：通过RT-PCR和western blot检测转染microRNA-18a或其抑制物后Dicer基因mRNA水平和蛋白水平的变化。通过MTT法和集落形成实验验证microRNA-18a对T24细胞增殖的影响。通过生物信息学分析预测Dicer mRNA中microRNA-18a的结合位点。应用荧光素酶报告基因技术验证microRNA-18a与Dicer的直接相互作用。结果：T24细胞中转染microRNA-18a后，细胞增殖受抑制，集落形成率平均下降70%，而抑制microRNA18a则可使T24细胞集落形成数平均增加2.75倍。转染microRNA-18a后，Dicer基因mRNA和蛋白水平均下调，而抑制microRNA-18a则上调了Dicer mRNA和蛋白。生物信息学分析显示Dicer mRNA的3’UTR存在2个Dicer结合位点，分别位于+1063和+4162处。报告基因法证实microRNA-18a可与该两个位点结合，并抑制荧光素酶的表达。结论：microRNA-17~92簇成员microRNA-18a可以转录后抑制Dicer表达，并可借此抑制膀胱癌T24细胞的增殖。