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毛细胞的修复再生是耳科领域研究的热点问题。目前的研究表明,损伤毛细胞再生的分子机制与胚胎期内耳发育的机制相似,都有多种信号转导途径共同发挥作用。方法本研究首先采用增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物dUTP缺口末端标记(TdT-mediated deoxyuridinetriphosphate-biotin nick end labelling,TUNEL)和透射电镜技术分别观察豚鼠正常发育过程前庭上皮细胞增殖和凋亡的变化,初步探讨两者之间的关系及在前庭终器发育中的作用;以免疫组化法检测豚鼠发育过程前庭器中胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)及其受体(IGF-1R)的表达的变化及分布特点,研究其与前庭上皮细胞增殖和凋亡的关系;利用免疫组化和Weston blot的方法,观察豚鼠发育期前庭器中胞外信号调控蛋白激酶1/2(extracellular signalregulated kinase1/2,ERK1/2)的表达、分布特点和活性变化。目的探讨哺乳动物正常发育过程前庭上皮细胞增殖、凋亡的变化及相关信号转 第四军医大学硕士学位论文导途径的分子机制,为进一步深入研究毛细胞的修复再生奠定基础。 结果 1.豚鼠正常发育过程前庭上皮细胞增殖和凋亡的变化 PCNA阳性细胞为支持细胞,毛细胞无阳性反应,随年龄增加,阳性细胞数逐渐减少(HO.05)。 TUN’EL阳性反应可发生干毛细胞和支持细胞,出生后壶腹峪阳性毛细胞位于其顶部。随年龄增加,阳性细胞数逐渐减少(P<0.01\ 电镜下胚胎期毛细胞和支持细胞均可发生凋亡。凋亡细胞胞核染色质浓缩、边集,包裹部分胞核凝积染色质而形成凋亡小体,胞浆内可见内质网明显扩张。 2.豚鼠正常发育过程前庭器中IGF-l及其受体表达的变化 IGF-1在豚鼠前庭上皮毛细胞和支持细胞中表达,主要位于胞浆,分布不均匀。随着年龄的增加,壶腹蹬感觉上皮IGF-1表达逐渐减少 (P<0.of)。成年豚鼠螺旋神经节神经细胞中 IGF八表达呈强阳性。 IGF-IR分布于壶腹蜡感觉上皮的毛细胞和支持细胞,两侧的移行细胞中也有较强的阳性表达,主要分布于细胞膜。随着年龄的增加,壶腹g@感觉上皮 IGF-IR表达逐渐减少(P<0.01)。 3.豚鼠正常发育过程前庭上皮 EAn/2的表达及活性的变化 ERK在豚鼠前庭上皮毛细胞和支持细胞中表达。主要位于胞浆,分布不均匀,壶腹蜡顶部细胞阳性反应重。随着年龄的增加,ERK在壶腹峪和椭圆囊斑表达逐渐减少(HO.01)。螺旋神经节神经细胞和两侧的移行细胞中ERKI呈强阳性。 EIUCZ分布于壶腹峪感觉上皮的毛细胞和支持细胞,同时在两侧的移行细胞中也有较强的阳性表达。主要分布于细胞浆。以壶腹峭顶部阳性染色重。随着年龄的增加,壶腹峭感觉上皮EMZ表达逐渐减少 (RO.01)。 各组前庭组织中均存在磷酸化EMI亿。ED40磷酸化EMI亿水平最高,DAB组有所减少,至二月磷酸化ERKI/2水平最低。各年龄组 2 第四军医大学硕土学位论文中磷酸化EMZ水平均明显高于磷酸化EMI。 结论 l.豚鼠内耳正常发育过程中,前庭上皮细胞增殖与细胞凋亡数目均逐渐减少,凋亡和增殖同时存在,自动调节前庭毛细胞数目,参与器官的正常形态的发生。 2.豚鼠正常发育过程前庭上皮中有IGF-l及其受体的表达,为内源性的IGF4,通过旁分泌和自分泌方式在局部发挥作用。壶腹崎感觉上皮IG卜l及其受体表达与细胞增殖相同步。IGF、在发育早期是强有丝分裂原,促进细胞增殖、分化;发育晚期可能与听神经元的神经发生及维持细胞存活有关。 3.豚鼠正常发育过程前庭上皮中有 ERK/二的表达,其表达量及活性与细胞增殖。分化相一致。ERKZ可能在哺乳动物前庭上皮细胞增殖、分化的信号转导途径中起主要作用。