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研究背景:感音神经性耳聋是耳鼻喉科的常见疾病,其主要原因是由内耳毛细胞和/或螺旋神经元的损伤导致,然而在哺乳动物,以上二者的损伤是不可能再生与修复的,因此干细胞移植替代受损的毛细胞和/或螺旋神经元治疗由此引起的感音神经性耳聋已成为耳科学研究的重点和热点问题。目的:1.通过体外培养建立稳定的诱导性多能干细胞(i PSCs)培养体系;2.利用耳毒性药物制作小鼠感音神经性耳聋模型;3.利用显微注射法将经CM-Di1标记的i PSCs经圆窗移植入小鼠耳蜗,观察移植细胞在耳蜗内的存活、迁移、分化情况,为利用i PSCs移植治疗感音神经性耳聋提供理论依据。方法:1.i PSCs的培养与标记:利用贴壁培养法培养稳定传代的小鼠i PSCs,并用荧光染料CM-Di1标记。2.感音神经性耳聋模型的制作:利用幼鼠皮下连续注射新霉素,通过听性脑干反应检测小鼠听力损失情况。3.小鼠i PSCs耳蜗移植:取40只造模成功小鼠随机平均分为实验组A和对照组B,同时取20只同批次正常小鼠作为正常组C,A组利用显微注射法将标记的小鼠i PSCs经圆窗移植入耳聋鼠耳蜗的Rosenthal’s管中,B组注射等量的DMEM基础培养液,4周后处死A、B、C组小鼠各10只,通过免疫荧光染色法和RT-PCR法观察移植细胞在耳蜗内的存活、迁移与分化情况。剩余小鼠用于ABR阈值的连续性观察。4.i PSCs移植后耳蜗HE染色鉴定是否有畸胎瘤形成。结果:1.成功建立稳定的小鼠i PSCs培养体系,并能在体外培养形成EB,RT-PCR可检测i PSCs多能性基因Nanog,Oct4,Sox2。2.连续皮下注射新霉素12天后,小鼠反应阈达70-80d Bn HL。3.A组和B组术后ABR阈值无改善。A组蜗轴和Rosenthal’s管中均可见红色标记的i PSCs,并且部分细胞表达毛细胞标记物和螺旋神经元标记物。B、C组耳蜗内未见红色荧光表达。4.各组小鼠术前、术后ABR阈值差异无统计学意义。5.HE染色鉴定i PSCs移植后耳蜗暂未见畸胎瘤形成。结论:1.本实验可成功建立稳定的小鼠i PSCs培养体系。2.CM-Di1可用于体外细胞转染和体内细胞的示踪。3.新霉素可诱导小鼠感音神经性耳聋,建立稳定的耳聋模型。4.小鼠i PSCs耳内移植后可分化为表达毛细胞标志物的毛细胞样细胞。5.小鼠i PSCs耳内移植后可分化为表达螺旋神经元标志物的螺旋神经元样细胞。6.经Rosenthal’s管径路移植i PSCs不能明显改善耳聋鼠的ABR阈值。7.小鼠i PSCs移植后短期内未见畸胎瘤形成。8.移植后的i PSCs主要分布于Rosenthal’s管和蜗轴中。