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内切-β-1,4-葡聚糖酶是纤维素酶系中的主要成员,可以将可溶性纤维素水解成还原性的寡糖。在酶的众多生物学性质中,其热稳定性非常重要,由于对高温环境表现极强耐受力的嗜热菌细胞中含有耐高温酶系而极具应用价值和开发潜力。虽然生长在海底火山环境中的严格厌氧嗜热微生物海栖热袍菌(Thermotoga maritima)具有产生内切-β-1,4-葡聚糖酶的能力,但由于培养困难,不适用工业规模的开发利用,采用分子生物学手段对该菌的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因进行克隆,构建可以常温培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌意义重大。1)海栖热袍菌中编码内切-β-1,4-葡聚糖酶的基因(TM1525),具有825 bp的开放阅读框,编码274个氨基酸。以分泌型pHT43穿梭质粒为载体,构建融合His标签蛋白的重组TM1525克隆质粒pHT43-TM1525,并通过大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α扩增,大量制备重组质粒。通过电转将重组质粒转入B.subtilis WB800N中进行表达。利用水解圈实验证明重组蛋白表达情况及水解纤维素酶活性。发酵上清液和菌体沉淀的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析结果表明目的蛋白实现了胞外分泌表达。2)通过Ni-NTA层析柱纯化融合His标签的重组蛋白,利用DNS法研究纯化后的目的蛋白酶活,结果显示为180.94 U/mg,最适pH为7.0,最适反应温度为80℃,并且具有较好的热稳定性,在60℃、70℃保温2.5 h后仍具有80%以上的残余酶活,80℃保温2 h后仍具有60%的残余酶活。3)通过响应面(Response Surface Methodology)的统计方法对重组蛋白的生产进行优化,实验设计选择了三个因素的影响:诱导温度、诱导时间和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加量,以每毫升发酵上清液的酶活力为响应值,使用Box-Behnken实验设计原理,进行17组实验后,采用Design-Expert v8.0.6软件进行分析得到二次多项式模型。通过RSM预测的模型,最佳发酵工艺参数为40℃,0.27mM IPTG诱导6.47 h,酶活为58.21 U/ml。为了验证优化的结果,进行三次重复实验,得到的实际值为57.90 U/ml,与理论值偏差较小,模型可靠。综上所述,枯草芽孢杆菌作为宿主菌,不仅易培养、无致病性,还实现了蛋白酶的胞外表达,且内切-β-1,4-葡聚糖酶具有较高的热稳定性,可在较高的温度下发挥作用,不易失活,便于包装和运输,可以在工业上进行大规模的开发和使用,广泛应用于食品行业、纺织行业、环保等领域,可大规模生产以满足市场需求。