口蹄疫（Foot and Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒引发的偶蹄兽的急性、烈性的传染病,严重阻碍了畜牧业的健康发展。灭活苗接种是我国控制猪O型口蹄疫的主要手段,但灭活疫苗存在免疫期短,诱导的细胞免疫应答水平不高,生产成本高等不足。因此,研制新型有效的猪O型FMDV疫苗具有重要意义。已有文献报道GEM颗粒（Gram-positive bacterial enhancer matrix particles,革兰氏阳性细菌增强子基质颗粒）表面展示系统具有特异性吸附并纯化与乳酸菌锚构蛋白PA3融合表达的外源可溶性蛋白,提高其免疫原性的作用。亦已探明VP1_141-160、VP1_200-213和3A_21-35分别是O型FMDV的保护性B细胞表位、Th2细胞表位和Th1细胞表位。对此,本研究以上述3个表位设计多表位肽并展示在GEM颗粒表面,制备细菌样颗粒疫苗并验证其免疫效果。主要研究内容与结果如下:首先,构建含FMDV抗原表位的原核表达重组质粒。以Epi_141-160、Epi_200-213和Epi_21-35设计3种不同形式的多表位串联肽,即TB（140¹60aa-GG-200²13aa）、BTTB（140¹60aa-GG-200²13aa-GG-21³5aa-GG-140¹60aa）及VP1*C（VP1全基因序列,将158位的P替换为C）,并委托生物公司将其克隆入pUC57载体。将多表位串联肽基因与表达质粒pQZ-PA3进行酶切连接,构建原核表达重组质粒pQZ-TB-PA3、pQZ-BTTB-PA3、pQZ-VP1*C-PA3。重组质粒经IPTG诱导表达后获得3种可溶性融合蛋白（rTB-PA3、rBTTB-PA3与rVP1*C-PA3）。免疫印迹的分析结果显示了它们均具有良好免疫反应性。其次,制备3种FMDV细菌样颗粒（BLP）载体疫苗并检测其免疫效果。用GEM颗粒吸附与纯化上述3种可溶性融合蛋白,透射电镜观察发现3种可溶性融合蛋白不规则地分布在GEM颗粒周围,浓度分别达到85μg/mL（rTB-PA3）、213μg/mL（rBTTB-PA3）和870μg/mL（rVP1*C-PA3）。将3种细菌样颗粒分别与白油佐剂乳化制成BLP疫苗,并免疫5周龄ICR小鼠,分别于免疫后21、35、42、49、56和63d采集血清,检测VP1蛋白特异性抗体水平与液相阻断抗体水平。于免疫后第35天进行淋巴细胞转化实验及脾脏中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α四种细胞因子mRNA表达水平检测。结果显示BLP/rBTTB-PA3能够有效刺激小鼠产生较高水平的VP1蛋白特异性抗体与液相阻断抗体;BLP/rBTTB-PA3免疫组的淋巴细胞增殖水平极显著高于其他BLP疫苗免疫组;BLP/rBTTB-PA3免疫组IFN-γ与IL-4的mRNA表达水平较其余2种BLP疫苗免疫组显著上调,但与合成肽疫苗免疫组无显著差异;所有实验组IL-10和TNF的mRNA表达水平均无明显差异。这些结果说明BLP/rBTTB-PA3疫苗的免疫原性最好,可诱导小鼠产生良好的体液免疫应答及Th1型细胞免疫应答。最后,检测免疫增强剂CVC1302对BLP/rBTTB-PA3免疫效果的影响。在BLP/rBTTB-PA3疫苗中添加CVC1302免疫增强剂后免疫ICR小鼠和口蹄疫抗体阴性仔猪,检测免疫血清中VP1蛋白特异性抗体水平和液相阻断抗体水平以及外周血淋巴细胞增殖水平。结果显示,BLP/rBTTB-PA3+CVC1302免疫组小鼠与仔猪血清中VP1蛋白特异性抗体水平和液相阻断抗体水平均显著高于BLP/rBTTB免疫组;BLP/rBTTB-PA3+CVC1302免疫组小鼠与仔猪外周血淋巴细胞增殖水平也显著高于BLP/rBTTB-PA3免疫组,表明免疫增强剂CVC1302可进一步提高BLP/rBTTB-PA3疫苗的免疫原性。综上所述,本研究成功制备出免疫原性较好的口蹄疫病毒细菌样颗粒载体疫苗BLP/rBTTB-PA3,CVC1302免疫增强剂可显著提高BLP/rBTTB-PA3的免疫原性。