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F-box蛋白FBXO31是一个衰老基因,乳腺癌候选抑癌基因。它与Skp1、Cullin类蛋白组成SCF类E3,参与泛素-蛋白酶水解途径。通过介导底物蛋白的降解,参与细胞增殖、发育、衰老,细胞周期调控等重要的事件。最近研究者们发现这个基因还有一个重要的功能,它是DNA损伤应答反应信号转导通路中的一个新的分支。DNA损伤后,FBX031被活化的磷酸激酶ATM磷酸化,使蛋白稳定且表达水平上升。细胞周期素D1的286位苏氨酸残基可能被MAPK磷酸化,磷酸化的细胞周期素D1被FBXO31降解从而使细胞周期阻滞在G1期,出现DNA损伤的细胞将不再继续分裂。
众所周知F-box蛋白FBXO31是SCF复合体的一部分,它能介导蛋白的降解。但是它本身是如何被降解,又是被谁降解的,目前仍不清楚。它的表达模式除了在乳腺癌中有报道以外,在其他癌症中还未见有报道。本文主要研究该基因在细胞细胞内的降解机制,以及它在肝癌细胞和组织中的表达,分析其对细胞周期的影响。
FBXO31位于人染色体16q24.2,在人类基因组中的位置为nt85974895-85920445之间。FBXO31基因mRNA全长3635bp,共11个外显子,9个内含子。FBXO31基因的转录本具有一个极短的5’非编码区,长度仅为23bp。开放读码框全长1620bp,编码539个氨基酸,预测其分子量为61kDa。它的CpG岛约为2.48kb,包含了第一个外显子。对FBXO31的氨基酸序列进行序列分析发现它含有1个F-box基序(64-110位氨基酸残基)和6个D-box基序(143-146、193-196、247-250、288-291、351-354、368-371位氨基酸残基)。它和F-box蛋白家族里的其他成员除了F-box基序外没有其它相似性。
为了探明FBXO31的降解机制,应用蛋白酶体抑制剂MG132处理Hella细胞,发现FBXO31蛋白在细胞中累积,提示FBXO31可以经由泛素-蛋白酶体降解通路进行降解。FBXO31的序列分析中发现其氨基酸序列中含有6个D-box序列RXXL,X代表任意氨基酸。D-box序列是被APC/C复合体中CDH1和CDC20识别的标志。在检测FBXO31细胞周期中内源表达水平时发现FBXO31的蛋白表达水平下降的时机与被APC/C复合体降解的时机相符。这些发现进一步暗示了FBXO31有可能被APC/C复合体降解。为了明确FBXO31是否被APC/C复合体降解,构建了FBXO31和APC/C复合体中的两个关键性蛋白CDH1及CDC20的真核表达质粒Myc-FBXO31、Flag-CDH1、Flag-CDC20,通过免疫共沉淀技术和泛素化实验探讨它与CDC20和CDH1的相互作用。结果表明,FBXO31可与CDH1相结合,而且增强CDH1的表达可以增强FBXO31的泛素化。因此可以推断FBXO31可以被APC/C复合体降解。FBXO31一共有6个D-box基序,为了探明是哪一个D-box基序在FBXO31与CDH1的结合中起决定性作用,通过PCR的方法对FBXO31的6个D-box基序进行定点突变,构建了6个D-box突变体。通过免疫共沉淀技术研究6个D-box突变体与CDH1的相互作用。结果表明,除了第五个突变体以外,所有突变体都可以和CDH1结合。
本文还进一步研究了D-box突变对FBXO31功能的影响。通过免疫共沉淀技术研究6个D-box突变体能否与Skp1结合。结果表明,所有D-box突变体都能与Skp1结合。这说明D-box突变对FBXO31与Skp1结合没有影响,不影响SCF复合体的形成。
通过荧光实时定量PCR技术和western blot技术检测在肝癌细胞系和肝癌组织中FBXO31 mRNA水平和蛋白水平的表达。结果表明与正常肝上皮细胞H17相比,Hep3B,MHCC97L,MHCC97H,HCCLM3,SNU-449细胞系中的FBXO31表达水平降低。在HepG2和SNU-449细胞系中表达呈上升趋势(约2.7和2.5倍)。在30/32检测的肝癌样本中,FBXO31的表达水平表达下调。
选取Hep3B细胞研究FBXO31在肝癌中表达下调的潜在机制。增强FBXO31的表达水平对细胞衰老,细胞凋亡没有影响,但是可轻微抑制细胞增殖,并且使细胞周期阻滞在G1期。增强FBXO31的表达水平可以是细胞周期素D1的内源表达水平下降。综上结果,可以推测FBXO31可能通过调节细胞周期素D1的内源表达水平来调控细胞周期。