肿瘤直径在1-2mm以下时，可通过组织液弥散作用获取营养，继续生长则 必须依靠新生血管供给营养。因此，血管生成是恶性实体瘤赖以生长的关键步 骤，也是肿瘤细胞通过血液转移的重要路径。越来越多的资料表明，摧毁肿瘤 内的新生血管，切断肿瘤的营养供应，可导致血管灌流区的肿瘤组织缺血性坏 死，从而达到显著的抗肿瘤效果，同时减少肿瘤细胞通过循环途径远处转移的 可能性。 自杀基因疗法是目前认为最具有临床应用潜力的肿瘤基因治疗策略之一。 以往的肿瘤自杀基因疗法均靶向肿瘤细胞。本研究则另辟蹊径，将自杀基因疗 法的作用机制与抗血管生成的显著优点相结合，设计出既靶向肿瘤血管内皮细 胞又靶向肿瘤细胞（而不仅仅是针对肿瘤细胞）的自杀基因疗法。 肿瘤自杀基因疗法要求自杀基因能选择性地在靶肿瘤细胞中表达，而在正 常细胞中不表达，以最大限度地杀伤肿瘤细胞，最小限度地损伤正常组织。一 个可能满足这一要求的方法是利用肿瘤特异性基因调控元件驱动自杀基因表 达。现己知道，肿瘤血管生成是由血管生成因子及其相应受体引发的，其中血 管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体 KDR（Kinase－domaine insert containing receptor，KDR）起着关键作用， VEGF主要通过KDR发挥其促进内皮细胞分裂及血管生成的作用。研究表明， KDR特异性地表达于血管内皮细胞，其表达水平与血管内皮细胞更新速度呈正 相关。通常情况下，血管内皮细胞更新缓慢，故KDR表达很低，而在许多人类 肿瘤血管内皮细胞中表达很高，并与肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移密切相 关。新近报道，KDR还广泛表达于不同组织来源的肿瘤细胞。根据KDR在不 同状态下的血管内皮细胞上的表达差异、选择性地在某些类型肿瘤细胞中的表 达以及由KDR启动子调控的基因表达系统可通过重组腺病毒载体转移技术实现 且 第二军医大学 中文摘要 硕土学位论文 在内皮细胞特异性表达的实验基础，本研究将构建一种由腺病毒介导的、受 KDR启动子驱动的自杀基因转移系统“dKDR｛K），利用该系统对体外培养的 血管内皮细胞系和肿瘤细胞系进行杀伤试验，期望KDR启动子调控自杀基因 HSV刁K在肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞中特异性表达，为建立一个可能具有破坏 肿瘤血管和杀伤肿瘤细胞作用并适用于多种恶性实体瘤的基因治疗方案奠定基 础。据我们所知，这是首次对KDR启动子调控HSV1K表达进行鉴定。 目的 探讨血管内皮细胞特异性表达基因KDR启动子调控自杀基因HSV丁K在肿 瘤内皮细胞和肿瘤细胞中特异性表达的可行性，为探索同时靶向肿瘤血管内皮 和肿瘤细胞的基因治疗新方案积累资料。 方法 1重组腺病毒AdKDR－TK和 AdCMV－TK的构建、鉴定与包装 以提取的正常肝组织基因组为模板，用自行设计的引物扩增目的基因片段 KDR启动子，然后将其与PGEM厂载体连接。目的基因经测序鉴定后，用 Xholl／Hindlll切取，将之与pBluescript 11 KS载体相连接。HSV－TK编码基 因及其PolvA序列取自于质粒nMCI－HSVTK，应用EcoRI／BalnHI双酶切，然后将 之定向克隆至pBluescriptll KS载体上，构建由KDR启动子操纵的HSV－TK表 达系统 KDR－TK（pBluescriptKDR－TK）。 以腺病毒系统AdEasy System为基因转移载体。应用 Xholl／Sail双酶切 获取自杀基因表达系统KDR呵K，将其克隆入穿梭载体pshuttle。所得质粒用 Pinel酶切使之线性化，然后用电穿孔法将其与腺病毒载体pAdEasyl共转化大 肠肝菌BJS 183进行重源重组，筛选kanamycin抗性重组子，重组结果经内切 酶 Pac分析证实，即得重组腺病毒质粒 pAdKDR－TK。同时以类似方法构建由 CMV启动子调控HSV丁K基因表达的重组腺病毒质粒PAdCMV1K。 将正确的重组质粒 PAdKDR－TK和 PAdCMV－TK分别转化 DHS Q细胞，氯化艳 梯度离心纯化质粒。在转染当天，用内切酶 Pac消化重组腺病毒质粒，然后 将线性化重组质粒转染入腺病毒包装细胞系293细胞。经大量扩增、氯化铬梯