HAX-1是一种抗凋亡蛋白，参与细胞迁移及细胞存活等过程调控，其编码基因突变会导致重型先天性中性粒细胞减少症（severe congenital neutropenia， SCN3，又叫Kostmann综合征）及神经系统疾病。c-Abl非受体酪氨酸激酶参与氧化应激过程调控，可以调节细胞对氧化损伤的抵抗力。ROS（Reactive oxygen species）激活胞浆中的c-Abl，通过调节过氧化氢酶（Catatlase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）将H2O2降解，而在无法控制的H2O2水平时则启动细胞凋亡机制。另外，过量的ROS会导致细胞内受损蛋白积累，蛋白酶体主要负责损伤蛋白的清除，而c-Abl可通过磷酸化蛋白酶体PSMA7亚基，进而影响蛋白酶体复合物的功能。前期研究发现HAX-1与c-Abl存在相互作用并且具有功能相关性。本研究旨在阐明HAX-1与c-Abl相互作用的生物学意义及分子机制，包括HAX-1的抗凋亡机制、c-Abl非受体酪氨酸激酶的活性调节机制及其氧化应激下生物学功能的调控机制，为深入认识HAX-1相关疾病的发病机理提供新的重要理论依据。　　在本研究中，首先通过免疫共沉淀、免疫印迹、in situ PLA等技术证实HAX-1和 c-Abl确实存在相互作用，并且在氧化应激（Oxidative stress）及离子辐射（ionizing radiation，IR）等条件下二者的结合水平显著升高，表明二者在应激条件下发挥某种共同作用。正常状态下c-Abl活性很低，处于自抑制状态，应激状态下c-Abl被活化。通过特异性磷酸化抗体的Westernblot检测发现，HAX-1的结合促进c-Abl蛋白的Y412位酪氨酸磷酸化水平，而412位酪氨酸的磷酸化水平代表了其活性状态。在对细胞进行H2O2处理之后，HAX-1显著增强氧化应激条件下H2O2对c-Abl的酪氨酸激酶的激活功能，表明HAX-1可以通过调节c-Abl活性来影响其生理功能如抗氧化损伤。　　另一方面，过度激活的c-Abl会启动降解机制，而前期研究发现HAX-1降低c-Abl半衰期，可能是通过促进其蛋白酶体降解实现。为证实这一设想，我们在HEK293及MCF-7细胞系中分别检测过表达及内源性c-Abl的泛素化水平，发现外源过表达的HAX-1可以显著增强c-Abl的泛素化水平；而将MCF-7细胞中的HAX-1进行RNAi之后，c-Abl的泛素化修饰几乎检测不到，说明HAX-1的确可以促进c-Abl的泛素化降解。我们知道，c-Cbl是介导c-Abl泛素化的泛素连接酶（ubiquitin ligase，E3），通过一系列实验我们证实HAX-1正是通过介导c-Abl与其E3 c-Cbl的结合来调节其泛素化修饰。　　以上说明HAX-1对c-Abl的调控是双面的：一方面HAX-1促进c-Abl在特殊条件下的活化，而当c-Abl过度激活时，HAX-1又会介导c-Abl与其E3结合，促进其泛素化降解，从而使得细胞内c-Abl的活性保持在一个合适水平，实现自我调控。　　既然HAX-1与c-Abl在氧化应激条件下相互作用增强，并且显著激活c-Abl的酪氨酸激酶活性，我们不难设想二者在抗氧化损伤方面行使某些共同的作用。我们首先构建 HAX-1 knockdown（ HAX-1 siRNA）、c-Abl/Arg knockdown（c-Abl/Arg siRNA）及c-Abl/Arg/HAX-1knockdown（c-Abl/Arg/HAX-1 siRNA）稳定细胞系，利用流式细胞仪技术分析三种细胞系中的ROS水平及细胞凋亡程度，发现三种细胞系中 ROS含量及凋亡率都升高至一个相似水平。当我们在HAX-1 siRNA细胞中回复表达 c-Abl后，ROS水平有明显下降，而回复表达HAX-1于c-Abl/Arg/HAX-1 siRNA中ROS则无明显差异。而且，c-Abl特异性抑制剂 STI571（Imatinib）处理之后，HAX-1的抑制对细胞凋亡水平无甚影响。以上表明，HAX-1的抗凋亡功能尤其是对抗氧化损伤导致的细胞凋亡功能依赖于c-Abl酪氨酸激酶。　　除了可通过磷酸化CAT、Gpx直接介导ROS降解之外，我们的工作发现c-Abl还可调节蛋白酶体的活性以清除氧化环境下细胞内积累的损伤蛋白。通过对c-Abl/Arg siRNA MCF-7及其野生型细胞内的蛋白酶体含量及活性分析后发现， ROS刺激后MCF-7细胞中蛋白酶体水平升高，而c-Abl KD之后蛋白酶体复合物水平并未受ROS影响。不仅如此，随着H2O2浓度的升高，KD细胞内蛋白酶体的降解能力持续降低（图14C），可能与ROS导致的蛋白酶体失活有关，然而在野生型MCF-7细胞内却不存在这种现象，可能是因为ROS刺激导致的蛋白酶体含量的增多抵消了这种不足，这表明，c-Abl激酶可以通过调节蛋白酶体复合物含量及其蛋白质降解能力来应对氧化应激环境。　　HAX-1的遗传性突变会导致SCN的发生，本研究发现，SCN相关的HAX-1突变体无法正常调节c-Abl，包括活性调节、表达水平调节及抗氧化损伤调节，表明HAX-1/c-Abl/ROS途径可能与SCN的发生有关。通过进一步研究，我们证实c-Abl特异性激活剂DPH可以保护MCF-7、SH-SY5Y和体外培养的中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）免受HAX-1缺失引起的氧化损伤。以上说明HAX-1突变导致的SCN是由于c-Abl活性失调导致的PMN氧化损伤引起的。临床研究发现，c-Abl抑制剂类药物在治疗 CML时常伴有中性粒细胞减少症副作用的发生。事实上，c-Abl特异性抑制剂Nilotinib确实可以造成诱导分化的类中性粒细胞（PMN-like）和小鼠体内的PMN氧化损伤，而抗氧化剂GSH（glutathione）则可以保护这些细胞。c-Abl激活剂DPH同GSH一样，可以缓解HAX-1缺失导致的PMN-like氧化损伤并且可以延长氧化应激环境下体外培养的PMN的生存寿命。这个结果进一步印证了上述结论，并且为治疗或缓解SCN及 CML病人的副作用提供了一个重要的理论研究基础，即利用 GSH等抗氧化剂进行临床治疗，该方法相对传统方法更为经济便捷。　　本研究阐明了应激条件下c-Abl活性调节的机制，并将HAX-1抗凋亡蛋白与 c-Abl非受体酪氨酸激酶及泛素-蛋白酶体系统的功能联系起来，首次解释了HAX-1如何对抗氧化损伤导致的细胞凋亡。同时深入探索 HAX-1相关疾病如Kostmann综合征的致病机制，为寻求早期干预及治疗方案提供了较为关键的理论基础。