茶树原花青素对牙本质基质生物改性作用的研究

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牙本质基质中存在由Ⅰ型胶原为主的胶原纤维网,如何提高牙本质基质的机械性能和抗酶解能力是牙本质修复过程的关键。原花青素可以显著改善牙本质基质中胶原的生物学性能,但是原花青素的生物学活性受到材料来源、提取方法、组成成分等多种因素的影响,因此需要选择适合临床应用的组成成分。最近的研究显示茶树根中含有丰富的的原花青素,但茶树中的原花青素在口腔中的应用价值尚没有被深入研究过。本文主要研究茶树来源的原花青素对脱矿牙本质基质的生物学作用。首先应用有机溶剂分级萃取得到茶树根乙酸乙酯、正丁醇和水三个提取物,通过柱层析方法对提取物进行分离,并借助高分辨质谱(ESI-HR-MS)进行定性分析并鉴定。接着将茶树根各提取物对牙本质胶原的生物改性作用以及对脱矿牙本质的促矿化作用进行了对比研究。之后用最具活性的正丁醇提取物,研究茶树原花青素对树脂牙本质粘接界面稳定性和人牙髓干细胞增殖和分化等方面的影响;最后利用部分原花青素二聚体和酯型儿茶素进一步探讨了原花青素与牙本质胶原作用的机制和效果。通过本次研究为口腔临床中优化选择原花青素的有效成分提供试验基础,并为茶树原花青素的资源开发提供一定的理论依据。完成的主要研究工作和成果总结如下:1、茶树根乙酸乙酯提取物的主要成分是儿茶素单体,正丁醇提取物的主要成分是聚合度为2~5度的原花青素,水提取物的主要成分是酚酸。将乙酸乙酯、正丁醇和水层三个提取物配制成溶液后处理脱矿牙本质胶原,通过茚三酮实验、吸水膨胀率检测、羟脯氨酸试剂盒检测牙本质胶原的降解量以及三点弯曲检测弹性模量等实验方法,对交联后的牙本质胶原的生物学性能进行对比研究。结果表明,以正丁醇提取物的生物学作用最好,可以显著提高牙本质胶原的交联度,降低胶原的吸水率,提高牙本质胶原的机械性能和对酶降解的抵抗力。2、通过对矿化后牙本质表面的显微形貌观察、X线衍射分析和显微硬度检测等研究发现,茶树根正丁醇提取物对脱矿牙本质基质的促矿化作用要优于氟化物和茶树根乙酸乙酯提取物,说明原花青素更适合用于牙本质再矿化,且促矿化作用与其组成成分有关,多聚体较单倍体组成的原花青素促矿化作用效果好。3、应用正丁醇提取物配制成茶树根原花青素溶液,于粘接前预处理脱矿牙本质,并设戊二醛为阳性对照组。分别在模拟树脂老化前和老化处理后对树脂牙本质条进行微拉伸测试,通过微拉伸强度检测、扫描电镜观察拉伸断裂后的断面显微形貌,研究茶树根原花青素对树脂粘接修复稳定性的影响。结果发现,粘接前应用原花青素处理脱矿牙本质对树脂牙本质的即刻粘接强度没有影响,茶树根原花青素能显著增强树脂粘接混合层中牙本质胶原对酶降解的抵抗力,提高老化处理后牙本质粘接的微拉伸强度。4、应用含不同浓度(0、0.1、1、10μg/m L)茶树根原花青素的培养液诱导h DPSCs,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况;通过碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色检测细胞成骨向分化情况;应用q-PCR检测各成骨/成牙本质相关基因的表达情况。结果表明,低浓度的茶树根原花青素对人牙髓干细胞的增殖无明显抑制作用。茶树根原花青素对h DPSCs成骨分化具有一定的诱导作用,茶树根原花青素可以上调h DPSCs成骨/成牙本质基因RUNX-2、COL-1、DSPP和OSX的表达,促进h DPSCs向成骨/成牙本质方向分化。5、应用原花青素二聚体Proanthodelphinidin B2 3,3’-O-gallate(EGCG-EGCG)、Procyanidin B2和酯型儿茶素EGCG及其衍生物EGCG-3’Me处理牙本质胶原,通过傅里叶变换红外光谱、抗酶降解能力和极限拉伸强度检测,研究原花青素二聚体和酯型儿茶素及其衍生物对牙本质胶原的生物改性作用。结果说明,EGCG-EGCG、EGCG和EGCG-3’’Me能显著改善牙本质胶原的生物学性能,以EGCG-EGCG的作用效果最好。6、采用Bio Visions胶原酶活性测定试剂盒检测原花青素二聚体和酯型儿茶素及其衍生物对对胶原酶的抑制作用,结果表明,原花青素的二聚体EGCG-EGCG和EC-EC对胶原酶活性均有较好的抑制作用。根据以上结果推测,原花青素与牙本质基质中胶原的作用过程中,其分子结构中酚羟基数量及其聚合度的大小是两个重要的影响因素,而酚羟基的数量可能起主导作用。茶树根原花青素对牙本质胶原、胶原酶以及人牙髓干细胞均表现了较好的生物学作用,说明茶树原花青素在牙科领域具有一定的开发利用价值。
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