研究背景和研究目的在真核生物中,蛋白质的翻译后修饰（PTM）,例如乙酰化、泛素化和磷酸化等,在细胞稳态和各种生理功能中都有突出的决定作用。到目前为止,有关乙酰化修饰的研究大都集中在赖氨酸残基上,而丝氨酸和苏氨酸的乙酰化修饰在过去可能未引起太大注意,这是因为鉴定这种修饰的难度较大,手段较少。但在2006年的研究,首次发现提出了真核细胞中蛋白的丝/苏氨酸残基可以被乙酰化修饰的证据:他们发现了来自耶尔森氏菌的毒力因子YopJ可以在真核细胞中,作为丝/苏氨酸乙酰转移酶,催化丝/苏氨酸残基乙酰化修饰。YopJ充当乙酰基转移酶,以乙酰辅酶A（CoA）为供体,催化乙酰基加到丝裂原活化蛋白激酶（MAPKK6）激活域中的关键丝、苏氨酸残基,使这些残基发生乙酰化修饰,从而同时阻止这些位点的被磷酸化。由此作者提出了丝氨酸和苏氨酸上的磷酸化和乙酰化修饰呈现拮抗的关系,并对细胞内信号传导起到重要的调节作用。因为丝/苏氨酸残基不仅可以被磷酸化也可以被乙酰化,显而易见,当MAPKK6激活域的活性位点Ser-222和Ser-226被乙酰化修饰后,这些关键性的丝、苏氨酸残基当然也就不能被磷酸化了,从而达到抑制MAPKK6活化的目的,减弱细胞内的免疫反应,达到细菌的繁殖入侵的目的。尽管来源于细菌的YopJ是一种苏氨酸/丝氨酸残基的乙酰转移酶,但YopJ是一种细菌性外源的乙酰转移酶,真核细胞中本身并不存在这种YopJ乙酰转移酶。从上述研究中,我们可以发现丝/苏氨酸上的乙酰化修饰对于细胞内信号传导具有重要的调节作用,但是目前为止,在真核生物体中,我们对内源性苏氨酸和丝氨酸残基的乙酰转移酶和去乙酰化酶都尚不清楚。苏氨酸和丝氨酸发生乙酰化修饰后应是可逆的,因为根据化学结构和反应,这些残基的羟基被乙酰化后形成的酯键,可能会被某种羧酸酯酶水解。因此,我们自然的想到酯酶D（ESD）,作为一种非特异性的酯酶,能否切割丝/苏氨酸发生乙酰化修饰后的酯键,而作为一种真核生物中的去乙酰化酶?因为在真核生物中ESD是一种很重要的羧酸酯酶,能特异性地水解唾液酸,去除9-氧-乙酰唾液酸的乙酰基;另外在酿酒酵母中,发现它可以水解4-甲基伞形酮乙酰酯上乙酰基团。这些研究都证明了 ESD具有去除乙酰酯键的能力,因此,我们自然地推断,酯酶D可能作为真核生物中丝/苏氨酸去乙酰化酶,可能调控其相互作用蛋白上丝/苏氨酸残基的去乙酰化修饰,进而调控细胞内的信号转导途径。研究结果1.ESD与JAB1相互作用1.1利用酵母双杂交技术,以ESD为诱饵,钓到了 JAB1蛋白,初步分析出ESD与JAB1存在相互作用。2.2进行细胞水平的正反免疫共沉淀（Co-IP）实验,直接证明了 ESD与JAB1确实存在相互作用。2.3在HEK293T细胞的裂解液中,利用JAB1的抗体,进行Co-IP并跑胶,将ESD对应分子量的条带切下,进行质谱（MS）鉴定,发现了 ESD的特征性多肽序列,这也证明了 JAB1可以与ESD免疫共沉淀。2.ESD可以去除JAB1-T89的乙酰化修饰2.1在HEK293T细胞中转染His-JAB1质粒,通过镍柱纯化His-JAB1蛋白,质谱分析发现JAB1第4位的丝氨酸、89位苏氨酸和95位的丝氨酸存在乙酰化修饰。2.2为了验证ESD能否去除JAB1的乙酰化的修饰,我们通过体外生理生化和质谱分析进行验证。首先合成了 JAB1上的19个多肽（JAB1的86-99位的氨基酸）,其中该多肽的JAB1-T89在合成时,被加入乙酰化修饰,从而模拟体内JAB1-T89被乙酰化的状态,该多肽分为两份,分别于活性ESD和失活ESD共同孵育6 h,37℃,MS检测分析,发现有活性的ESD的处理组中去乙酰化的多肽含量显著高于失活ESD组。这直接证明了 ESD具有去除JAB 1苏氨酸乙酰化修饰的能力。3.ESD促进了 JAB1-T89的磷酸化3.1构建的JAB1这3个乙酰化位点的点突变体（His-JAB1-S4A、His-JAB1-S95A和His-JAB1-T89A）,将这3个突变质粒和野生型质粒分别在HEK293T细胞中异位表达,利用Co-IP方法发现乙酰化位点突变后的JAB1与ESD的相互作用都显著降低了。3.2将上述构建的JAB1的3个点突变体以及野生型,分别转染到HEK293T细胞中,通过His抗体免疫沉淀,然后利用广泛的磷酸化抗体进行western blot检测,发现当JAB1第89苏氨酸点突变后,JAB1的磷酸化水平显著降低了,而这些突变体转染到ESD敲除HEK293T细胞系（ESD-/-）中后,JAB1的野生型和JAB1-T89A的磷酸化水平就没有明显的变化了,这说明JAB1-T89存在磷酸化修饰,并且受到ESD的调控。3.3与野生型细胞系相比,ESD敲除细胞系的JAB1苏氨酸磷酸化程度较低。4.ESD的激活剂FPD5能增加JAB1-T89的磷酸化水平4.1我们实验室之前筛选出了 ESD的激活剂FPD5,可显著提高ESD酶活,通过Co-IP和细胞免疫荧光,发现了 FPD5处理后,可以显著增加ESD与JAB1的相互作用。4.2在野生型细胞系中,发现FPD5激活的ESD后,可以显著提高JAB1苏氨酸的磷酸化水平,而在ESD-/-的细胞系中,FPD5不再发挥作用,这说明FPD5是通过激活ESD促进JAB1的苏氨酸磷酸化水平的。4.3 FPD5只能提高JAB1-WT的磷酸化水平,而对JAB1-T89A没有显著性影响,这说明FPD5激活ESD后,会促进JAB1-T89位点的磷酸化修饰。5.FPD5抑制oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化5.1在oxLDL处理的巨噬细胞中,ESD的酶活受到了显著抑制,而当FPD5处理后,可以恢复并显著增加ESD的活性。5.2利用油红O染色,在oxLDL存在的情况下,随着FPD5浓度的增加,正常形态的RAW 264.7巨噬细胞的数量显著升高,泡沫细胞显著减少,而且从这些细胞提取的油红O的含量也显著降低。5.3在对照细胞中,FPD5处理RAW 264.7,油红O 阳性染色的阳性细胞数量和油红O含量显著降低,但在ESD siRNA（siESD）转染的细胞中却没有显著变化,表明FPD5通过ESD阻止了 oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞形成。6.FPD5通过激活ESD/JAB1/ABCA1途径促进胆固醇外流6.1 FPD5处理后巨噬细胞中p27Kipl的水平较低,在巨噬细胞中通过siESD敲低ESD后,FPD5无法降低p27Kipl水平。这表明FPD5通过ESD可以激活JAB1的功能。6.2 FPD5处理后,巨噬细胞中ABCA1的含量显著升高。但是,在巨噬细胞中通过siESD敲低ESD后,FPD5无法再增加ABCA1水平。与野生型JAB1（His-JAB1-WT）相比,磷酸化位点突变后的JAB1（His-JAB1-T89A）不能再稳定ABCA1蛋白水平。这说明JAB1-T89的磷酸化修饰对于ABCA1的稳定至关重要。6.3在对照组中,FPD5处理后胆固醇外排能力增大,而当ESD或JAB1敲低后,消除了该效果。oxLDL处理巨噬细胞后,细胞内胆固醇水平显著升高,而当FPD5处理后,巨噬细胞内的oxLDL水平明显降低。这表明FPD5通过ESD/JAB1促进巨噬细胞胆固醇外流的。