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目的：
再生是面对有毒化学物质或手术切除引起的功能性细胞丧失的肝组织的独特防御机制。在这项研究中，发现胰岛细胞自身抗原69（ICA69）可加速小鼠的肝脏再生。进行70%的局部肝切除术后的肝再生的早期阶段，ICA69mRNA和蛋白质在小鼠肝细胞中明显增强。与野生型小鼠相比，ICA69[-/-]小鼠肝损伤严重，肝再生延迟，肝切除术后手术意外死亡率更高。进一步的研究发现ICA69蛋白和PICK1蛋白相互作用从而调节TGFβR1蛋白的表达以及TGFβ诱导的Smad磷酸化。ICA69在肝脏组织中的新发现为促进肝脏再生提供了新的潜在靶标。
方法：
（1）为了研究ICA69表达水平在肝脏发育过程中是否恒定，收集了处于不同发育阶段（E14.5；E16；E20；P2；P10；P20；P60）的小鼠肝脏组织，并检测了ICA69mRNA以及第E16，P20和P60天检测ICA69蛋白;在C57B/L小鼠中进行70％的PH，并检测了肝再生过程中ICA69的表达水平;两步灌注用于分离肝细胞，并收集高度纯化的肝细胞,比较70％PH之前和48小时后肝细胞中ICA69的蛋白水平。
（2）对8周龄的雄性WT小鼠及其ICA69[-/-]小鼠进行了70％的PH手术,比较WT和ICA69[-/-]小鼠的再生肝重量;计算了肝脏再生过程中的肝脏/体重比，对血清AST和ALT进行了定量;在70％PH后的不同时间点对肝脏切片进行Ki-67染色;测定肝再生过程中细胞周期相关基因包括cyclin D，cyclin A和p21的表达;计算70％PH期间的意外死亡率。
（3）检测PICK1在小鼠肝组织中的表达以及再生肝脏组织中PICK1的蛋白质水平模;在永生化肝细胞细胞系L02中过表达或删除ICA69，并检测PICK1蛋白;接下来研究PICK1的降解途径
（4）检测ICA69KO小鼠肝脏中的TGFβRI蛋白水平;检测L02细胞和ICA69KO的L02细胞的TGFβRI蛋白水平;检测小鼠肝脏和L02细胞中的pSMAD磷酸化。检测WT和ICA69KO小鼠的TGFβ1血清水平;检测TGFβ在体外细胞活力中的作用。
（5）为研究控制ICA69mRNA转录的关键因素，分析ICA1/ica1启动子;使用TFSEARCH（一种用于定位转录因子结合位点的工具），在人和小鼠ICA1/ica1基因启动子中鉴定了一个共有转录因子c-Myc结合域;通过HDI在小鼠肝脏中瞬时过表达人c-Myc基因。
结果：
（1）ICA69在肝再生期间具有动态表达。ICA69mRNA和蛋白质的水平均在72小时之前达到峰值，然后逐渐下降至基础水平。
结果：表明ICA69在肝细胞增殖中起作用；为了进一步阐明肝脏中ICA69升高的起源，比较了70％PH之前和48小时后肝细胞中ICA69的蛋白水平，与上述数据一致，再生肝细胞中的ICA69显着增加，表明其在肝细胞增殖中的作用。
（2）在手术48小时后，可见WT小鼠的肝脏大小大于ICA69[-/-]小鼠肝叶。进一步计算了肝脏再生过程中的肝脏/体重比，对比进而发现WT小鼠的肝脏质量的恢复要比ICA69[-/-]小鼠好。ICA69[-/-]小鼠肝质量恢复的延迟表明再生肝的功能受到更严重的损害。作为肝损害的指标，对AST和ALT进行了检测。如预期的那样，ICA69[-/-]小鼠组的ALT和AST水平显着升高。ICA69[-/-]的肝细胞在36小时和60小时的时间点具有非常低的增殖率。此外，ICA69[-/-]肝脏中cyclin D，cyclin A mRNA的表达比WT低，且p21的mRNA比WT高。这些结果表明，ICA69通过调节肝切除后细胞周期相关基因来控制肝细胞增殖的速率。
（3）PICK1肝组织中mRNA高度表达，但PICK1蛋白处于低水平。在L02细胞中过表达的ICA69增加了内源性PICK1蛋白，而CRISPR cas9内源性删除ICA69降低了内源性PICK1表达。溶酶体抑制剂氯喹可阻止PICK1的降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则不能，这表明溶酶体降解途径与其降解有关。另一方面，溶酶体和蛋白酶体的降解途径似乎都参与了ICA69介导的降解。
（4）ICA69[-/-]小鼠肝脏中的TGFβRI蛋白水平显着高于WT小鼠。与此相一致，与对照细胞相比，具有ICA69KO的L02细胞具有显着更高的TGFβRI蛋白表达。在较高的TGFβRI下，ICA69KO小鼠中再生肝脏的pSMAD磷酸化程度更高。在5ng/ml TGFβ刺激下，具有ICA69KO的L02细胞在20和30分钟的时间点具有很强的pSMAD磷酸化。用10ng/mlTGFβ处理的带有ICA69KO的L02细胞具有明显较低的生存力。
（5）48小时后，c-Myc mRNA的表达量对照组增加了13倍。肝组织中过度表达的c-Myc使ICA69mRNA的表达比对照明显增加了3倍。
结论：
（1）ICA69敲除后肝再生能力与野生型有显著差异。
（2）ICA69通过下调TGFβRI和减弱小鼠TGFβ信号来加速肝脏再生。
再生是面对有毒化学物质或手术切除引起的功能性细胞丧失的肝组织的独特防御机制。在这项研究中，发现胰岛细胞自身抗原69（ICA69）可加速小鼠的肝脏再生。进行70%的局部肝切除术后的肝再生的早期阶段，ICA69mRNA和蛋白质在小鼠肝细胞中明显增强。与野生型小鼠相比，ICA69[-/-]小鼠肝损伤严重，肝再生延迟，肝切除术后手术意外死亡率更高。进一步的研究发现ICA69蛋白和PICK1蛋白相互作用从而调节TGFβR1蛋白的表达以及TGFβ诱导的Smad磷酸化。ICA69在肝脏组织中的新发现为促进肝脏再生提供了新的潜在靶标。
方法：
（1）为了研究ICA69表达水平在肝脏发育过程中是否恒定，收集了处于不同发育阶段（E14.5；E16；E20；P2；P10；P20；P60）的小鼠肝脏组织，并检测了ICA69mRNA以及第E16，P20和P60天检测ICA69蛋白;在C57B/L小鼠中进行70％的PH，并检测了肝再生过程中ICA69的表达水平;两步灌注用于分离肝细胞，并收集高度纯化的肝细胞,比较70％PH之前和48小时后肝细胞中ICA69的蛋白水平。
（2）对8周龄的雄性WT小鼠及其ICA69[-/-]小鼠进行了70％的PH手术,比较WT和ICA69[-/-]小鼠的再生肝重量;计算了肝脏再生过程中的肝脏/体重比，对血清AST和ALT进行了定量;在70％PH后的不同时间点对肝脏切片进行Ki-67染色;测定肝再生过程中细胞周期相关基因包括cyclin D，cyclin A和p21的表达;计算70％PH期间的意外死亡率。
（3）检测PICK1在小鼠肝组织中的表达以及再生肝脏组织中PICK1的蛋白质水平模;在永生化肝细胞细胞系L02中过表达或删除ICA69，并检测PICK1蛋白;接下来研究PICK1的降解途径
（4）检测ICA69KO小鼠肝脏中的TGFβRI蛋白水平;检测L02细胞和ICA69KO的L02细胞的TGFβRI蛋白水平;检测小鼠肝脏和L02细胞中的pSMAD磷酸化。检测WT和ICA69KO小鼠的TGFβ1血清水平;检测TGFβ在体外细胞活力中的作用。
（5）为研究控制ICA69mRNA转录的关键因素，分析ICA1/ica1启动子;使用TFSEARCH（一种用于定位转录因子结合位点的工具），在人和小鼠ICA1/ica1基因启动子中鉴定了一个共有转录因子c-Myc结合域;通过HDI在小鼠肝脏中瞬时过表达人c-Myc基因。
结果：
（1）ICA69在肝再生期间具有动态表达。ICA69mRNA和蛋白质的水平均在72小时之前达到峰值，然后逐渐下降至基础水平。
结果：表明ICA69在肝细胞增殖中起作用；为了进一步阐明肝脏中ICA69升高的起源，比较了70％PH之前和48小时后肝细胞中ICA69的蛋白水平，与上述数据一致，再生肝细胞中的ICA69显着增加，表明其在肝细胞增殖中的作用。
（2）在手术48小时后，可见WT小鼠的肝脏大小大于ICA69[-/-]小鼠肝叶。进一步计算了肝脏再生过程中的肝脏/体重比，对比进而发现WT小鼠的肝脏质量的恢复要比ICA69[-/-]小鼠好。ICA69[-/-]小鼠肝质量恢复的延迟表明再生肝的功能受到更严重的损害。作为肝损害的指标，对AST和ALT进行了检测。如预期的那样，ICA69[-/-]小鼠组的ALT和AST水平显着升高。ICA69[-/-]的肝细胞在36小时和60小时的时间点具有非常低的增殖率。此外，ICA69[-/-]肝脏中cyclin D，cyclin A mRNA的表达比WT低，且p21的mRNA比WT高。这些结果表明，ICA69通过调节肝切除后细胞周期相关基因来控制肝细胞增殖的速率。
（3）PICK1肝组织中mRNA高度表达，但PICK1蛋白处于低水平。在L02细胞中过表达的ICA69增加了内源性PICK1蛋白，而CRISPR cas9内源性删除ICA69降低了内源性PICK1表达。溶酶体抑制剂氯喹可阻止PICK1的降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则不能，这表明溶酶体降解途径与其降解有关。另一方面，溶酶体和蛋白酶体的降解途径似乎都参与了ICA69介导的降解。
（4）ICA69[-/-]小鼠肝脏中的TGFβRI蛋白水平显着高于WT小鼠。与此相一致，与对照细胞相比，具有ICA69KO的L02细胞具有显着更高的TGFβRI蛋白表达。在较高的TGFβRI下，ICA69KO小鼠中再生肝脏的pSMAD磷酸化程度更高。在5ng/ml TGFβ刺激下，具有ICA69KO的L02细胞在20和30分钟的时间点具有很强的pSMAD磷酸化。用10ng/mlTGFβ处理的带有ICA69KO的L02细胞具有明显较低的生存力。
（5）48小时后，c-Myc mRNA的表达量对照组增加了13倍。肝组织中过度表达的c-Myc使ICA69mRNA的表达比对照明显增加了3倍。
结论：
（1）ICA69敲除后肝再生能力与野生型有显著差异。
（2）ICA69通过下调TGFβRI和减弱小鼠TGFβ信号来加速肝脏再生。