解淀粉芽孢杆菌PEBA20异质性变异特征及degS基因突变株的初步构建

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本研究跟踪了解淀粉芽孢杆菌PEBA20持续继代培养条件下的生物膜表型与抗真菌活性,检测了典型变异株的生物膜形成与抗菌活性;确定了变异株SCEV与野生株在生物膜形成、抗菌活性以及二者相关基因表达水平方面的差异。初步构建了degS基因的缺失突变株。主要研究结果如下:  1.在单一环境持续继代培养条件下,PEBA20生物膜表型产生了变异,这种变异具有明显的异质性特征。PEBA20在整个继代过程中产生了20种生物膜表型,生物膜表型组成的Shannon指数随着继代次数的增加呈递减趋势。在继代过程前期,丰富度指数维持较高水平,均匀度指数维持较低水平。在继代后期,三种多样性指数保持相对稳定,PEBA20形成多样性低、变异幅度小的稳态株系。  2.持续继代培养过程中,PEBA20抗真菌活性随着培养时间的推移产生变化。PEBA20对苹果腐烂病菌(Valsa mali)和杨树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)菌落生长的抑制率呈现了“高-低-高-低”的变化过程。与出发株相比,稳态株系对两种指示真菌的抗菌活性显著降低。  3.五种典型变异株在生物膜形成方面有明显差异,且具有不同的抗菌活性。五种典型变异株的生物膜形成在大小、边缘特征、表面特征三个方面显著不同,最终形成的生物膜结构明显不同。典型变异株发酵液对指示真菌(V.mali、B.dothidea、Bipolaris maydis)和两种指示细菌(Clavibacter michiganense和Ralstonia solanacearum)的抗菌活性明显不同。  4.变异株SCEV的生物膜表型可稳定遗传。与野生株相比,变异株SCEV不能形成复杂的生物膜结构、抗真菌活性降低、抗细菌活性升高。变异株SCEV生物膜形成、抗菌活性相关基因表达检测结果表明,变异株SCEV tasA、epsA、srfAD、bmyA、fenA、dfnA、baeD基因的表达量分别是野生株的0.02倍、1.68倍、0.41倍、0.23倍、0.50倍、4.42倍,1.43倍。  5.设计了合理可行的degS基因缺失突变株构建方案,构建了重组自杀质粒de gSF-de gSB-p WM91并电转化入PEBA20感受态细胞。PCR扩增获得同源前臂degSF和同源后臂degSB,克隆了同源前臂和同源后臂连接片段degSF-degSB,构建了重组自杀质粒degSF-degSB-pWM91并电转化入PEBA20感受态细胞,后续的氨苄筛选和蔗糖筛选工作正在进行中。
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