【摘 要】
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同源结构域Nkx6.2是由同源盒基因Nkx6.2编码产生。它作为一种反式作用因子,在中枢神经系统（central nervous system.CNS）胚胎期神经母细胞特化和生后期少突胶质细胞特化、成熟及髓鞘形成过程中,都发挥重要的调控作用。本课题组在前期研究中发现,脑发育时期甲状腺激素（thyroid hormone, TH）不足会造成CNS内重要神经细胞异常,同时伴随Nkx6.2低表达。然而,
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同源结构域Nkx6.2是由同源盒基因Nkx6.2编码产生。它作为一种反式作用因子,在中枢神经系统（central nervous system.CNS）胚胎期神经母细胞特化和生后期少突胶质细胞特化、成熟及髓鞘形成过程中,都发挥重要的调控作用。本课题组在前期研究中发现,脑发育时期甲状腺激素（thyroid hormone, TH）不足会造成CNS内重要神经细胞异常,同时伴随Nkx6.2低表达。然而,在因TH不足而导致的脑发育迟滞病理过程中,转录因子Nkx6.2具体的参与机制还不明确。通过给予甲状腺功能减低模型外源性Nkx6.2的方法,将有助于解决或部分解决这一问题。改变基因表达水平的传统策略是基因转染,此技术存在插入诱变的风险。与之相比,直接转导目的蛋白内化进入细胞的方法,不仅可以避免这种风险,并且不会影响转导细胞的基因组表型。因此,本文将TAT蛋白转导域(protein transduction domain.核定位信号（nuclear location sequence. NLS）一起与Nkx6.2融合表达。首先,提取大鼠脑组织的总RNA,逆转合成cDNA后,通过PCR扩增获得大鼠Nkx6.2编码基因的外显子序列。同时,利用化学合成方法获得TAT、NLS的编码序列。然后,将以上目的基因插入融合型原核表达载体pQE-30Xa,构建重组表达质粒pQE-30Xa/TAT-NLS-Nkx6.2（以下简称TN-Nkx6.2）。之后将其转化入E. coli M15[pREP4]进行融合表达,最终获得具有细胞渗透性的融合蛋白TN-Nkx6.2。表达产物经Ni2+-IDA亲和层析纯化后,标记荧光染料Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Cy7-N-hydroxysuccinimide ester. Cy7NHS）经尾静脉向小鼠注射Cy7-TN-Nkx6.2后,应用活体荧光成像系统监测融合蛋白在脑部的动态分布,结果表明,融合蛋白能够通过血脑屏障（blood-brain barrier.BBB）到达脑组织；免疫荧光组化实验证明融合蛋白内化进入神经细胞胞浆、胞核；同时,该融合蛋白在短期内并未对脑组织细胞表现出明显的生物毒性。
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