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放射性脑损伤（Radiation brain injury,RBI）指头颈部恶性肿瘤放疗后一种严重的并发症,目前尚缺乏有效的治疗方法。海带多糖（Laminaria japonica polysaccharides,LJP）是海带中分离提取的生物活性多糖,具有提高免疫力、抗肿瘤、防辐射等作用。本课题组前期研究发现LJP能改善RBI的记忆功能障碍,然而其机制尚未清楚。鉴于此,本项目通过体外培养神经细胞、脑血管内皮细胞,建立放射损伤的神经细胞、内皮细胞模型,从细胞和分子水平观察LJP对放射损伤的神经细胞和脑血管内皮细胞的影响,揭示LJP在放射诱导脑损伤中的作用机制。1.第一部分:SD乳鼠神经细胞、脑血管内皮细胞的分离、原代培养和鉴定清洁级12h内新生的SD乳鼠,取脑皮质,分离和培养皮质中的神经元、神经胶质细胞及脑微血管内皮细胞,在倒置显微镜下观察不同培养时间的细胞形态和数量变化,体外培养至细胞成熟后利用NSE、GFAP、vWF抗体分别标记神经元细胞、神经胶质细胞及脑血管内皮细胞,进行免疫荧光染色鉴定,结果表明:（1）神经元细胞:培养4-5 h,大部分细胞贴壁,胞体呈圆形,少数细胞出现细小的突起,24 h细胞数量增多,突起变长,少数细胞间的突起出现连接,2-3 d胞体增大,呈椭圆形,突起变长、变粗,突起间的连接增多,4-6 d胞体聚集成团,7-8 d细胞间突起之间形成典型的神经网络,荧光免疫组化可见,胞核大、圆、亮,NSE表达于胞浆和突起中,突起间相互交织成网络状。（2）神经胶质细胞:培养3-5h,细胞贴壁,光晕明显;1-2d,细胞开始铺展,并生长出细长的胞突;4-5d,细胞体积明显增大,长出胞突的细胞明显增多;7d已长满培养瓶瓶底。纯化传代后,胶质细胞呈星形,或不规则,胞突丰富,分支多,一级胞突较粗,常有二级分支。免疫荧光染色可见GFAP表达于胞浆和突起中。（3）脑血管内皮细胞:培养24h,血管段和细胞已贴壁,细胞呈短梭形。3-5d大量细胞沿着微血管段生长,以接种部位为中心形成岛屿样增生,不同群落之间不重叠,集落内的细胞排列出现漩涡状且逐渐相互融合。6-8d各细胞之间开始聚合成片,细胞之间的大小和形状较为均匀,呈现“铺路石样”的外观。传代24h可见梭形细胞散在的贴壁,5d时已融合成片,继续传代后的细胞仍然保留内皮细胞的特性,呈典型的“铺路石”样的形态。免疫荧光染色可见vWF表达于胞浆中。2.第二部分:海带多糖对放射诱导损伤的体外神经细胞和脑血管内皮细胞的影响随机将长势良好、无污染的细胞分为对照组、LJP组、放射组、放射+LJP组。放射组和放射+LJP组予60Coγ照射,照射剂量10 Gy;对照组、LJP组置于相同的环境,不予照射。放射后24h,取细胞培养液,离心,采用ELISA检测相应的细胞因子表达、细胞免疫荧光染色结合图像分析阳性细胞数和吸光度值。（1）LJP对放射诱导损伤神经元的保护作用:（1）神经元细胞数与对照组比较,放射后细胞数量和吸光度值均明显减少（P<0.05）,而LJP干预的放射+LJP组未见差异（P>0.05）,LJP组与对照组相比也无明显差别（P>0.05）;（2）Bax/Bcl-2表达放射后放射组细胞培养液Bcl-2表达明显下降,而Bax表达升高,而予LJP干预的放射+LJP组未见改变（P>0.05）。与对照组相比,LJP组Bcl-2/Bax表达也无明显差异（P>0.05）。（2）LJP对放射诱导损伤的神经胶质细胞的影响:（1）胶质细胞数量放射前后,各组胶质细胞神经胶质细胞数量未见差异;（2）Bax、Bcl-2、TNF-α表达放射后各组细胞培养液中Bax、Bcl-2和TNF-α表达未见明显差异（P>0.05）。（3）LJP对放射诱导损伤的内皮细胞的影响:（1）脑血管内皮细胞数量与对照组相比,放射后vWF阳性细胞数及吸光度值明显减少（P<0.05）,经LJP干预后,放射+LJP组、LJP组v WF阳性细胞数和吸光度与对照组无明显差异（P>0.05）。（2）vWF、PAI-1和t-PA因子表达与对照组相比,放射后放射组内皮细胞细胞培养液中vWF和PAI-1含量明显升高（P<0.05）,而t-PA因子水平较对照组明显降低（P<0.05）,对照组、放射+LJP组、LJP组间无明显差异。综上所述,本研究结论1.本实验采用12h内新生的SD乳鼠皮层行原代神经元、神经胶质细胞及脑血管内皮细胞培养是成功的。2.60Coγ射线可以诱导Bax表达促进体外培养神经元损伤,而LJP通过诱导神经元Bcl-2表达和抑制Bax产生保护放射诱导损伤的神经元。3.60Coγ射线可以促进内皮细胞释放vWF、PAI-1因子,抑制t-PA的释放,而LJP通过抑制vWF、PAI-1因子释放,促进t-PA因子释放,保护放射损伤的内皮细胞4.10Gy剂量下60Coγ射线对体外培养的神经胶质细胞未见影响。