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在大多数动物里,早期的胚胎发育产生两大类细胞:体系细胞和种系细胞。种系细胞源于原始生殖细胞(PGC),PGC是从早期胚胎的体细胞中分化而来的,经过长距离的跋涉迁移到生殖腺,然后形成精子和卵子,精卵结合产生新的个体,从而保证物种的延续和进化。因此了解生殖细胞的形成、发育及其命运维持的分子机制对操作生殖细胞极为关键。作为生殖细胞的标记基因,piwi和vasa的表达模式和功能分析在物种间广为研究。本文旨在以青鳉为模式生物,研究piwi和vasa的表达模式及其在鱼类生殖细胞形成与发育过程中的作用。
Piwi基因最早是从果蝇卵巢中分离出来的,对生殖干细胞的增殖和分裂有调控作用,其功能在进化上具有保守性。目前青鳉piwi的研究还没有报道,本研究克隆到的青鳉piwi基因(opiwi)cDNA全长为2.9kb,编码857个氨基酸,在N端和C端分别具有保守的PAZ结构域和PIWI结构域。系统树显示opiwi属于piwi亚族,和斑马鱼的piwi相似性最高。Opiwi和人的piwi基因具有相似的基因结构和染色体分布。Opiwi RNA是母源性的,在整个胚胎发育过程都有表达。在早期的胚胎发育过程中,Opiwi RNA和蛋白均匀分布在每个卵裂球;在体节期,opiwi除了在PGC大量表达外,我们还发现其在眼睛、脑以及尾部等体细胞也有微弱表达。oPiwi蛋白以颗粒状分布在PGC的核周。在成体组织里,opiwi RNA和蛋白虽然在性腺大量表达,在眼和脑神经系统也有表达。在性腺里,opiwi RNA和蛋白仅在生殖细胞里有表达,而在其他体细胞则没有表达。在卵子发生过程中,opiwi在卵原细胞和早期的卵母细胞大量表达,随着卵子发育,其表达逐渐下降,在成熟的卵母细胞里,其信号呈点状或薄层分布;在卵母细胞里,opiwi和线粒体共定位于卵子的生殖质结构巴尔氏小体(Balbiani body);我们还发现在卵原细胞里,oPiwi蛋白以中空的颗粒分布在其核周;此外oPiwi蛋白除了在细胞质有分布外,在细胞核也有分布,其细胞核定位和PCNA(proliferating cell nuclearantigen)及线粒体相同。在精子发生过程中,opiwi RNA和蛋白在精原细胞和精母细胞大量表达,opiwi的RNA在精子细胞和精子里没有信号,而其蛋白在精子细胞和精子里持续表达,且和线粒体共定位于生精细胞的生殖质结构拟染色体(chromatoid body);oPiwi蛋白在精原细胞的细胞质和细胞核都有分布,而在其他生精细胞则只在细胞质有分布。oPiwi还以中空的颗粒结构分布在精原细胞的核周。在干细胞系中,opiwi RNA和蛋白都有大量表达,其蛋白在细胞质和细胞核均有分布。此外,我们还发现opiwi3非编码区(3untranslatedregion,3UTR)在囊胚晚期(9hpf)就能特异性地标记PGC,而目前报道最早能区分青鳉PGC的nanos3 UTR则是在原肠早期(13hpf)。我们通过减少或增加opiwi的表达来研究其功能,PGC用nanos启动子驱动的绿色荧光和vasa启动子驱动的绿色荧光双标记(NgVg),这样我们可以从原肠中期就可以追踪PGC的发育。结果表明注射opiwi的Morpholino(MOpw)消减opiwi的表达对PGC发育和早期胚胎发育以及体细胞发育具有双重作用:MOpw导致PGC数目减少以及异位PGC,同时早期的胚胎发育和晚期胚胎发育的体细胞的发育也受影响;体外细胞培养表明,注射MOpw导致PGC和体细胞的分裂受阻。而MOpw和opiwi的RNA共注射能挽救MOpw的表型。进一步的实验表明是母源性的opiwi影响生殖细胞的发育和早期的胚胎发育,而合子性的表达仅影响晚期胚胎的体细胞发育。过量表达正常或缺失去掉PAZ结构域的RNA也影响生殖细胞发育和胚胎发育。因此,opiwi除了影响青鲻的生殖细胞的形成发育这一高度保守的功能外,我们还发现其在体细胞的发育也起着重要作用。
Vasa是进化上功能保守的翻译调控因子。它最初从果蝇中分离出来,对前后轴的极化和生殖细胞的形成是必需的。vasa同时在其他物种的生殖细胞的发育也起着重要作用,但它在早期的胚胎发育和生殖细胞的发育中的具体功能还不清楚。迄今,青鳉的vasa RNA仅见于生殖细胞,vasa启动子的活性亦是生殖细胞特异的,其蛋白的表达尚无详细的报道。本研究表明vasa RNA和蛋白的表达模式和opiwi基本一致,即是母源性的,在胚胎发育的原肠前期表达很强,随后开始降低。在早期的胚胎发育过程中,vasa均匀分布在每个卵裂球;在器官发生期,vasa除了在PGC大量表达,此外还在体细胞如脑、躯干和尾部也有表达。Vasa蛋白和oPiwi蛋白以中空的颗粒分布在PGC以及性原细胞的核周。在成体组织中,vasaRNA除在性腺大量表达外,在体细胞也有微弱表达。Vasa RNA和蛋白仅在性腺的生殖细胞有表达。在卵子发生,vasa RNA和蛋白在整个卵子发生都有表达,且和oPiwi共定位于巴尔氏小体。Vasa蛋白在卵母细胞的细胞质和细胞核都有分布。在精子发生阶段,vasa RNA和蛋白在精原细胞和精母细胞大量表达,vasa RNA在精子细胞和精子里没有信号,而其蛋白在精子细胞和精子也有微弱表达。Vasa蛋白在精原细胞的细胞质和细胞核都有分布,而在其它生精细胞仅在细胞质有表达。在精子细胞和精子阶段,Vasa和oPiwi共定位于拟染色小体。与其表达模式相对应的是,vasa在青鳉鱼PGC的发育和体细胞的发育过程中具有双重作用。注射MO消减vasa的翻译表达,PGC不能迁移到目的地一生殖腺。单个细胞的体内体外实验表明消减vasa的表达不改变PGC的动性,存活能力和分裂。即使在性腺外的异位PGC也具有动性,能够存活和分裂。将注射MOvas的胚胎的细胞在中囊胚时期移植到同样时期的野生型胚胎,PGC不能迁移到生殖腺。并且,注射MOvas,还会导致早期发育阶段胚胎大量死亡,活着的胚胎也伴随大量体系细胞的死亡;将注射MOvas后的胚胎的细胞在原肠早期分离出来,在体外培养第四天,也观察到大量的体细胞死亡。因此,我们推测vasa在青鳉的胚胎发育过程中具有双重作用:在生殖细胞的发育过程中,它对生殖细胞的迁移是必要的、自主性的;在体系细胞中,它在原肠期胚胎分层和体细胞的维持方面起着重要作用。我们还证实了生殖腺外异位的PGC和体外培养的PGC有维持着它自身特性的能力,即PGC的特性是自主性的。
综上所述,opiwi和vasa主要在青鳉的生殖细胞里表达并起作用,同时我们也证实这2个基因在体细胞发育具有新功能。