论文部分内容阅读
急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是临床常见致死性的综合征,但是AKI的发生发展机制复杂,目前缺乏有效干预手段。肾脏缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)是常见的AKI病因。IRI可引起肾小管上皮细胞发生损伤,甚至死亡,导致肾功能急剧下降。既往研究表明,亲环素D(Cyclophilin D,CypD)开放细胞线粒体膜通透性转变孔(mitochondrial membrane permeability transition pore,MPTP)可引起细胞损伤进而介导肾脏IRI;但是其中引起CypD开放MPTP的机制尚未阐明。同期研究也发现在心肌、神经元等细胞中p53可与CypD相互结合从而开放MPTP。目的:本研究通过体内实验,观察大鼠肾脏IRI中p53及CypD的变化对肾小管上皮细胞损伤的作用;进一步运用体外细胞模型,探讨p53-CypD在肾脏IRI中的作用机制。方法:1.体内实验:SD大鼠双侧肾脏缺血35分钟,再灌注24小时建立IRI动物模型,检测血清肌酐及尿素氮水平、PAS染色观察肾脏病理改变、Western blot及TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡、透射电镜观察肾小管上皮细胞线粒体形态学改变、Western blot及免疫荧光染色观察肾小管中CypD及p53的改变。2.体外实验:在体外ATP耗竭细胞模型中,使用环孢素A(CsA)抑制亲环素D功能或siRNA下调p53的表达;通过Western blot及Annexin V-FITC/PI染色检测不同处理下细胞的凋亡情况、JC-1染色检测不同处理下细胞线粒体膜电位转换(mitochondrial permeability transition,MPT)、免疫荧光染色及免疫共沉淀观察CypD与p53的相互作用。结果:1.体内实验:a)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠血清肌酐及尿素氮显著升高,其肾小管上皮细胞出现空泡变性、脱落、肿胀,并主要在皮质及外髓外部出现广泛管型及小管堵塞;b)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠肾脏cleaved-caspase3的蛋白表达显著上调、肾小管上皮细胞凋亡率(TUNEL染色阳性比例)显著增加;c)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠肾小管上皮细胞线粒体出现明显的肿胀或变形、双层膜结构丧失、线粒体嵴断裂或消失;d)与对照组及假手术组比较,IRI组大鼠肾脏CypD表达无明显改变,p53显著上调并与CypD共定位。2.体外实验:a)与对照组比较,ATP耗竭的HK-2细胞凋亡率(Annexin V阳性细胞比例)增加、cleaved-caspase3的蛋白表达显著上调、发生MPT的细胞比例增加、p53表达增加,但是CypD表达无改变;b)与ATP耗竭组及溶剂对照组比较,CsA预处理的HK-2细胞经受ATP耗竭时,细胞凋亡率减少、cleaved-caspase3的表达水平显著下调、发生MPT的细胞比例减少、p53及CypD表达均无改变;c)与ATP耗竭组及siRNA对照组比较,si-p53预处理的HK-2细胞经受ATP耗竭时,细胞凋亡率减少、cleaved-caspase3的表达水平显著下调、发生MPT的细胞比例减少、CypD表达无改变;d)与对照组比较,ATP耗竭促进HK-2细胞p53与CypD形成复合物。结论:在肾脏IRI中,p53及CypD能够调控肾小管上皮细胞线粒体通透性转换及凋亡,且这种调控可能是通过形成复合物实现的。