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第一部分毒理学研究1慈济化癌保生Ⅱ号方吸收成分研究目的:慈济化癌保生Ⅱ号方(Ciji Hua’ai Baosheng Ⅱ Formula,简称CHB-Ⅱ-F),由茯、党参、牡蛎、酸枣仁、陈皮、炒麦芽、丹参、平贝母8味药组成,临床应用多年,疗效较好,但作用的物质基础不明。通过实验研究CHB-Ⅱ-F的吸收生物活性成分,有助于阐明复方发挥作用的物质基础。方法:(1)将以上8味饮片混合煎煮,浓缩并制成冻干粉备用。精密称取复方水煎液冻干粉末,超声溶解。运用超高效液相色谱法(UHPLC)和高分辨率电喷雾质谱检测器(HR-ESⅠ-MS)分析CHB-Ⅱ-F水煎液以及血清吸收生物活性成分。(2)SPF级昆明小鼠20只,将2×107/mL肝癌H22细胞悬液接种于小鼠右前腋皮下,一周后成功长出肉眼可见肿瘤后,一次性大剂量200 mg/kg(0.2 mL/10g)腹腔注射5-氟脲嘧啶,建立H22肝癌小鼠皮下移植瘤化疗后模型。随机分为2组:空白组、给药组(CHB-Ⅱ-F)。次日开始给药,空白组以蒸馏水0.2 mL/10g进行灌胃;给药组以1.625 g/mL(32.5g/kg)灌胃中药CHB-Ⅱ-F,1次/日,连续7天。第7天灌胃给药1h后,摘眼球,取外周血,分离血清。结果:(1)超高效液质谱联用法能检测出CHB-Ⅱ-F水煎液含有10种组分:原儿茶醛、咖啡酸、斯皮诺素、黄芩苷、丹酚酸C、橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、川陈皮素。(2)超高效液质谱联用法检测出CHB-Ⅱ-F含药血清中有4种组分:β-谷甾醇、丹酚酸B、补骨脂乙素、补骨脂酚。结论:CHB-Ⅱ-F水煎液及含药血清中均含吸收生物活性成分,其临床应用的物质基础可能与所检测出的活性成分有关。2慈济化癌保生Ⅱ号方急、慢性毒理学研究目的:按照中药药效毒性试验研究要求,评价CHB-Ⅱ-F在正常小鼠和大鼠服用后有无急、慢性毒性反应。方法:急性毒性试验中,每只小鼠按117g/kg(3.9g/mL)灌胃,24h灌胃3次,连续灌胃14天,并记录小鼠的一般情况,不良反应及死亡率。慢性毒性试验中,大鼠分别按97.5 g/kg、48.75 g/kg、24.375 g/kg(分别相当于人临床剂量的30倍、15倍、7.5倍)灌胃CHB-Ⅱ-F,连续4周。观察CHB-Ⅱ-F灌胃4周及停药恢复期2周后的大鼠慢性毒性反应及停药后可能出现的毒性可逆反应。每日详细记录大鼠的一般情况及死亡数量,每周记录一次体重及摄食量。连续灌胃给药4周和停药恢复期2周时分别检测大鼠的血液学指标、生化指标、脏器重量、大小便常规以及主要脏器组织病理变化。结果:急性毒性试验中CHB-Ⅱ-F按117g/kg(3.9g/mL)每次灌胃小鼠,未观察到不良反应及小鼠死亡,测定该方对小鼠最大耐受量大于351 g/kg,相当于临床剂量的108倍。慢性毒性试验中,连续灌胃4周结束后,按97.5g/kg灌胃的雄性大鼠血液生化学指标总胆固醇(TCHO)增加,心脏和脾脏指数相对升高;雌性大鼠体重增加;血液学检查中红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)增加;按48.75 g/kg灌胃的雄性大鼠血液生化指标中的甘油三酯(TG)增加;按24.375 g/kg灌胃的雄性大鼠肝脏系数升高;脾脏指数升高。连续灌胃4周后其余检测项目以及恢复期2周后所有血液常规、血液生化、大小便常规、摄食量及主要组织病理染色均未见异常。结论:CHB-Ⅱ-F的小鼠最大耐受剂量大于351g/kg。大鼠大剂量服用CHB-Ⅱ-F连续服用4周,无明显脏器病理损伤;停药2周后未观察到明显不良反应。因此,CHB-Ⅱ-F每日剂量少于351 g/kg或者连续4周每日服用剂量为24.375 g/kg均被认为是安全的。第二部分作用及机理研究3研究慈济化癌保生Ⅱ号方对肿瘤小鼠化疗后癌凋亡作用及机制目的:CHB-Ⅱ-F是传统中药复方,长期应用临床可减轻肿瘤患者化疗后的不适症状,提高生存质量,延长生存周期,但其作用机理尚未完全阐明。本研究从促凋亡角度探讨CHB-Ⅱ-F对H22肝癌移植瘤化疗后小鼠肿瘤细胞的相关作用及机理。方法:SPF级昆明小鼠72只,将H22肝癌细胞悬液(2X107/mL)等体积接种于小鼠右前腋皮下,一周后成功长出肉眼可见肿瘤后,大剂量5-氟脲嘧啶按200 mg/kg(0.2 mL/10g)一次性腹腔注射,建立H22肝癌小鼠皮下移植瘤化疗后模型。随机分为6组:模型组、西药对照(5-FU)(20 mg/kg)组、中药对照组(养正消积胶囊)(0.78 g/kg)及CHB-Ⅱ-F低(16.25 g/kg)、中(32.5 g/kg)、高(65 g/kg)组。造模次日开始给药,14天后剥离肿瘤,称重,计算肿瘤指数,采用流式细胞术检测瘤细胞周期和凋亡率,分别运用HE染色光镜观察瘤组织病理改变和透射电镜观察肿瘤细胞超微结构改变,运用蛋白印迹法测定小鼠肿瘤组织中活化的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2及Bax蛋白的表达。结果:CHB-Ⅱ-F三个剂量组前后体重增加与模型组比较,差异有统计意义。与模型组比较,CHB-Ⅱ-F给药组第7天时,肿瘤体积明显较小;第14天时,CHB-Ⅱ-F高剂量组肿瘤体积大小明显减小且差异存在统计学意义。用药各组分别与模型组比较,不同程度减轻肿瘤组织的病理改变,超微电镜观察均出现不同程度的凋亡。CHB-Ⅱ-F中、高剂量组肿瘤细胞在G0-G1期和S期所占百分比与模型组比较差异显著,CHB-Ⅱ-F高、中剂量组的瘤细胞凋亡率均高于模型组。经蛋白印迹检测,CHB-Ⅱ-F低、中、高剂量组活化Caspase-3蛋白表达显著增加,CHB-Ⅱ-F中、高剂量组与中药对照组活化Caspase-8表达显著增加;CHB-Ⅱ-F低、中剂量组在Caspase-9蛋白表达显著增加,CHB-Ⅱ-F中剂量组活化Caspase-9表达较模型组增加。CHB-Ⅱ-F低、中组的促凋亡蛋白Bax表达明显增加;表明CHB-Ⅱ-F低、中剂量组可以引起Bax/Bcl-2的比值增加。结论:CHB-Ⅱ-F可改善H22肝癌移植瘤化疗后小鼠的毛发、饮食等一般情况;可减缓小鼠移植瘤生长速度;不同程度减轻肿瘤组织的病理改变,减少肿瘤细胞增殖,促进瘤细胞凋亡;辅助化疗的作用机制可能与调节肿瘤凋亡相关蛋白表达有关,从而促进肿瘤细胞凋亡。