论文部分内容阅读
轮状病毒(Rotavirus，RV)、诺瓦克病毒(Norovirus，NV)、星状病毒(Astrovirus，AV)和甲肝病毒(Hepatitis A virus，HAV)是引起食源性病毒性疾病的重要原因。贝类由于其滤过性摄食的特性，被认为是食源性病毒传播的高危载体。目前世界上绝大多数国家的均没有相关的病毒学标准用于食源性病毒的检测。因此，建立新的方法检测水体和贝类中病毒，对于保障人类身体健康和经济发展具有重要意义。本研究以水体和贝类中污染的轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒和甲肝病毒为研究对象，研究四种食源性病毒灵敏、快速的分子检测和高效的病毒浓缩方法，并对实际样本中食源性病毒的污染状况进行调研，研究结果可显著提高我国贝类和水体食源性病毒检测和疾病控制地时效性。1．建立了四种食源性病毒的单一及多重RT-PCR检测技术，确定所建立检测方法的特异性和灵敏度水平。研究中所选用的引物、经优化确定的反应体系和条件高度特异，完全可应用于临床及环境样本中食源性病毒的筛选和检测。以可检测到的病毒RNA量为检测限指标，在单一RT-PCR中，诺瓦克病毒和星状病毒的最低检测限为5pg，轮状病毒和甲肝病毒最低检测限为10pg；在多重RT-PCR中，轮状病毒、诺瓦克病毒和星状病毒的最低检测限为50pg，甲肝病毒为100pg。对128份临床腹泄样本检测，其中轮状病毒62(48.44％)份，诺瓦克病毒8(6.25％)份，星状病毒11(12.5％)份和甲肝病毒4(3.12％)。2．建立了轮状病毒和诺瓦克病毒以核酸序列为基础的扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification，NASBA)检测方法。轮状病毒和诺瓦克病毒的检测限均为5pg。其特异性和灵敏度通过Norethern和斑点杂交进一步得到了验证，即使反应体系中存在高浓度的外源核酸，均有清晰的目标带产生，无任何非特异性条带产生，表现出很高的特异性。NASBA法扩增效率高、灵敏度高、快速易操作，且不需扩增仪等特殊仪器，尤其适用在基层单位推广应用。3．探讨了三氯化铝沉淀法和正电荷滤膜法在自来水和生活污水中的病毒回收效率，确立了高效的病毒浓缩方法。结果表明，三氯化铝沉淀法在两种水体中的回收率均较高，最高回收率分别达到96.04％和91.98％。但正电荷滤膜法在两种水体中的回收率差别较大。在自来水中，正电荷滤膜法的最高回收率为93.85％，在污水中的最高回收率仅为69.9％，这说明正电荷滤膜法适用于病毒含量较高且悬浮物等杂质较少的样本。在应用于自来水样时，两种方法均可起到有效的病毒浓缩和监测作用，但在悬浮物等杂质较多的污水中，三氯化铝法具有较好的回收效率。4．建立了人工污染模式，验证所建立的检测及病毒浓缩方法的可行性及效率，并在实验中分别以整只贝和仅以消化道为样进行检测初步表明，消化道是贝类浓缩病毒的主要组织部位。5．首次对珠江三角洲水产贝类及珠江广州段内河涌水的病毒污染情况进行调研，初步了解和掌握了病毒的污染状况。广州市河涌水中食源性病毒污染的总阳性率为37.8％。以广东省淡水养殖场、水产市售贝类为调查对象，共42份贝样中检出2个轮状病毒阳性和1个甲肝阳性。病毒阳性样本均是从牡蛎中检出。表明相对于其它种的贝，牡蛎对病毒的浓缩能力要强。