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脱落酸-成熟-胁迫响应蛋白(Abscisic acid-,stress-,and ripening-induced proteins,ASR)是广泛存在生物体中与渗透调节有关的家族蛋白,具有转录因子和LEA蛋白的基本特征,在调控植物抗逆性形成方面发挥着重要作用。本实验从柽柳转录组数据鉴定了一条胁迫响应基因,其具有一个典型的ABA/WDS结构域,属于植物脱落酸-成熟-胁迫响应蛋白基因,命名为ThASR3。该基因全长309 bp,编码103氨基酸,编码蛋白质的分子质量为11.45kD,等电点为9.1。利用实时荧光定量RT-PCR技术分析显示,该基因受高盐、干旱诱导上调表达,暗示ThASR3可能在柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。构建ThASR3基因的过表达载体,蘸花法转化拟南芥,获得T3代转基因株系。对野生型和转基因株系拟南芥进行NaCl和Mannitol胁迫处理,胁迫条件下转基因株系的根长、鲜重及长势都优于野生型株系,表明ThASR3基因能提高转基因拟南芥的耐盐性和耐早性。在NaCl和Manntiol胁迫下,通过对WT、Line1和Line2的T3代纯合株系的DAB、NBT、Evans blue组织化学染色的抗逆能力分析,结果表明:在转基因植株中O2和H2O2最低,细胞膜完整性最好,说明ThASR3基因在拟南芥中过表达显著提高转基因植株的抗逆性。构建了 RNAi 载体 pFGC5941-ThASR3,并将 pROKII-ThASR3、pFGC5941-ThASR3及空pROKII瞬时转化到柽柳中,分别获得过表达、抑制表达及对照柽柳转基因植株。对转基因柽柳进行NaCl及Mannitol胁迫。利用DAB、NBT及Evas Blue染色结果表明,在三种转基因植株中,过表达柽柳的O2和H2O2与抑制表达的植株相比,含量较少,且细胞膜损伤最严重。说明ThASR3基因在柽柳中过表达使转基因植株的抗逆性显著提高。测定三种转基因植株的POD和SOD活性、PRO含量、甜菜碱含量、可溶性糖含量、H202含量、MDA含量、离子渗透率等生理指标,结果显示过表达植株(OE)的H202含量、ROS含量和MDA含量相对最低,POD活性和SOD活性、甜菜碱含量、可溶性糖含量、PRO含量相对最高;RNAi植株的H202含量、ROS含量和MDA含量相对最高,POD活性和SOD活性、甜菜碱含量、可溶性糖含量、PRO含量相对最低。以上研究表明,ThASR3能够提高转基因植株活性氧(ROS)清除能力,降低细胞受损伤程度,从而提高植株的抗逆能力。构建植物表达载体pBI121-GFP-T4SR3,利用基因枪技术瞬时转化洋葱表皮研究亚细胞定位,结果表明ThASR3蛋白在细胞核和细胞质均有表达。利用酵母双杂交技术研究ThASR3转录激活活性,结果表明在酵母中ThASR3无转录激活活性,同时也无法形成同源二聚体,推测其可能并不是作为一个转录因子发挥功能。在后续研究中拟构建盐和干旱胁迫下的柽柳酵母双杂交文库,筛选ThASR3的互作蛋白,进一步揭示ThASR3的在柽柳胁迫应答中的作用机制。