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胰腺癌是高度恶性的消化系统肿瘤,发病率和死亡率逐年上升。2018年全球统计数据显示:胰腺癌发病率2.5%,死亡率4.5%,分别居世界第14位和第7位。胰腺癌发病隐匿,进展迅速,对放化疗均不敏感,诊断时多已属于中晚期,手术切除率仅占20%,且术后复发率、转移率极高,5年生存率仅约8%。因此,现阶段深入探索胰腺癌发生发展的分子机制,寻找有效的治疗靶点尤为重要。2003年4月,人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的测序工作完成,揭示了人类基因组中只有1%-1.5%的DNA能够编码蛋白,而98%以上的序列属于非编码RNA(non-protein coding RNA,ncRNA),即所谓的“junk DNA”。同年9月,美国国立人类基因组研究院(US National Human Genome Research Institute,NHGRI)启动了继HGP之后又一项跨国基因组学研究项目——DNA原件百科全书(encyclopedia of DNA Elements,ENCODE),旨在解析人类基因组所有的功能元件,该项目用时9年的时间揭示了人类基因组中至少80%的ncRNA是有生物活性的,而并非之前认为的“垃圾产物”。根据转录本所含碱基的多少,ncRNA可分为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和短链非编码RNA,如微小RNA(microRNA,miRNA)。LncRNA是一类长度大于200nt,由RNA聚合酶Ⅱ转录,缺少开放阅读框(open reading frame,ORF),不参与或很少参与编码蛋白质的RNA分子。大量研究发现,lncRNA在基因表达的各个层面发挥分子调控作用,参与肿瘤的病理生理过程并与疾病的预后息息相关。因此,深入研究胰腺癌中差异表达的lncRNA,了解其作用机制,对于改善患者预后将具有非常重要的意义。2001年Science杂志同期发表了3篇miRNA的文章并首次提出miRNA的概念。大部分miRNA基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录成300-1000nt的初级体miRNA(primary miRNA,pri-miRNA),而后pri-miRNA在Drosha酶作用下加工形成70-90nt的含有茎环结构的前体miRNA(precusor miRNA,pre-miRNA),pre-miRNA进入细胞质后在Dicer酶的作用下剪切成21-25nt的双链miRNA,继而解旋为成熟的单链miRNA。成熟的miRNA能够与Ago蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC),通过碱基互补配对的方式识别并作用于靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR),使mRNA发生降解或者抑制其翻译成蛋白质,从而降低靶基因的蛋白表达。LncRNA重要的分子调控模式之一是竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)。LncRNA与mRNA的3’UTR均富含miRNA识别元件(miRNA recognition elements,MRE),lncRNA能够通过竞争性结合miRNA,部分解除miRNA对其靶基因的抑制作用,从而导致靶基因的表达水平上调。本研究通过高通量基因芯片技术筛选出胰腺癌组织中差异表达的lncRNA分子,发现长链非编码RNA LINC00994在胰腺癌中显著高表达,且之前没有相关资料报道,具有广泛的研究价值。我们应用real-time qPCR在10对临床组织样本中验证其表达水平,结果与芯片检测数据一致,为后续实验的展开奠定了基础。接着,我们挑选LINC00994基础表达水平较高的两株胰腺癌细胞Panc-1和AsPC-1,通过转染shRNA干扰质粒敲低其内源性LINC00994的表达,从功能缺失的角度研究sh-LINC00994对胰腺癌细胞生物学行为的影响。结果发现:沉默LINC00994能够抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促使细胞凋亡。因此,我们推测LINC00994在胰腺癌中可能发挥促癌基因的作用。为深入探讨LINC00994发挥促癌作用的潜在分子机制,我们利用之前的3对组织样本,使用Agilent Human miRNA,Release 21.0(8*60K,Design ID:070156)基因芯片筛选胰腺癌中差异表达的miRNA分子,以∣Fc∣≥10且P值≤0.01为标准,最后筛选出表达差异最显著的miR-765-3p(Fc=23,p=0.00089)。综合miRanda,TargetScan和RNAhybrid数据库信息,我们发现:miR-765-3p与LINC00994之间存在2个潜在的作用位点;RUNX2(Runt-related transcription factor-2)作为miR-765-3p的下游靶基因,3’UTR区含有1个miR-765-3p结合位点。GEPIA数据库预测:RUNX2在胰腺癌中高表达,与LINC00994的表达显著正相关(spearman相关性分析:p=0.0022,r=0.23)。经real-time qPCR和Western blot实验验证:miR-765-3p在胰腺癌组织中低表达,并与LINC00994的表达显著负相关;RUNX2在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁对照组织。过表达LINC00994,RUNX2的mRNA和蛋白表达水平显著升高,而敲低LINC00994或RUNX2能够显著降低彼此的表达水平,说明LINC00994和RUNX2之间存在正向调控关系。此外,通过过表达和沉默miR-765-3p,我们发现miR-765-3p能够负向调控LINC00994和RUNX2的表达。因此,我们推测LINC00994可能通过干扰miR-765-3p与RUNX2的靶向结合,促进胰腺癌的发展。为了证明上述科学假设,我们构建包含LINC00994(1015或647位点)片段或包含RUNX2 3’UTR的pmirGLO双荧光素酶报告基因载体,应用双荧光素酶报告基因系统检测miR-765-3p是否直接靶向作用于LINC00994和RUNX2,并验证结合位点。实验结果显示:共转染miR-765-3p-mimic和pmirGLO-LINC00994 WT(1015或647位点)或pmirGLO-RUNX2 3’UTR WT载体的HEK293细胞,荧光素酶活性显著降低,而共转染miR-765-3p-mimic和结合位点发生突变的pmirGLO-LINC00994 MT(1015或647位点)或pmirGLO-RUNX2 3’UTR MT载体,则miR-765-3p对荧光素酶活性的抑制作用消失。同理,我们将miR-765-3p-mimic和pmirGLO-RUNX2 3’UTR WT载体共转染sw1990细胞,荧光素酶活性显著降低,而过表达LINC00994能够逆转荧光素酶活性,说明LINC00994能够竞争性结合miR-765-3p。最后,为了更全面阐述LINC00994/miR-765-3p/RUNX2轴的作用机制,我们进行了rescue实验,结果发现:miR-765-3p能够逆转LINC00994对RUNX2表达水平的调控;miR-765-3p-inhibitor能够逆转sh-LINC00994对胰腺癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用,提示LINC00994能够通过miR-765-3p调控RUNX2的表达,并影响胰腺癌的生物学行为。综上所述,本研究发现LINC00994在胰腺癌中显著高表达;敲低LINC00994能够抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;LINC00994能够通过LINC00994/miR-765-3p/RUNX2轴发挥促癌基因的作用。