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目的:
探讨急性脑梗死热证、非热证患者外周血淋巴细胞微小:RNA(microRNA,miRNA)表达谱的特征及差异,为中西医结合辨证提供分子生物学依据。
方法:
按照纳入标准及排除标准收集2010年3月至2010年6月在首都医科大学宣武医院神经内科急诊及住院的急性脑梗死热证、非热证患者各3例,正常对照组2例,分别登记编号,采集每例患者的基本情况、现病史、既往史、个人史等资料,发病72小时内对患者进行美国国立卫生研究院卒中量表(national institute of health stroke scale,NIHSS)、改良Rankin量表(modified rankin scale,Mrs)、日常生活活动量表(barthelindex,BI)、火热证评分,并进行空腹血糖、血常规、尿常规、生化全项、糖化血红蛋白、同型半胱氨酸、凝血四项、血小板聚集率、C反应蛋白、血沉、头颅MRI、脑动脉及颈动脉超声检查。同时用含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetr,EDTA)的试管留取外周静脉血4ml,分离淋巴细胞提取总RNA,然后利用Agilent人miRNA表达谱芯片完成miRNA的微阵列试验;应用聚类分析、主成分分析等方法分析急性脑梗死热证、非热证患者外周血淋巴细胞miRNA表达谱的特征及差异。从中挑出6个差异miRNAs,用real-timePCR法检测其在热证、非热证患者血清中的表达。对病例基本资料及实验数据进行统计分析。
结果:
1、用于芯片分析的患者均为男性,其中热证组3例,平均年龄56±7.00岁,非热证组3例,平均年龄53.33+4.61岁,对照组2例,平均年龄49.00±1.41岁;热证与非热证患者年龄、性别、体温、脉搏、呼吸频率、血压、身高、体重及合并脑血管病的危险因素的组间比较无统计学差异,具有可比性。两组患者入院时NIHSS、BI、Mrs评分、红细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、血小板计数、血红蛋白、糖化血红蛋白、同型半胱氨酸、C反应蛋白、血小板聚集率、凝血四项、纤维蛋白原、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、Apoa、Apob、血沉的组间比较无统计学差异;但火热证评分、白细胞计数、总蛋白的组间比较有统计学意义(P<0.05),热证患者的总白细胞计数显著高于非热证患者,而热证患者的总蛋白显著低于非热证患者。
2、有全基因组探针参与的主成分分析显示:样本分为三个聚类群,与样本实际生物学特征相符;选取1-3倍差异变化的miRNAs基因探针参与的主成分分析显示:样本分为三个显著聚类群,与样本实际生物学特征相符。提示此差异基因群能够代表我们分类的样本生物学特征,可初步支持热证、非热证的分型。
3、聚类分析显示8个标本分为三个簇(热证、非热证、正常),分别筛选组间差异表达具有统计学意义的miRNA,得出:
①热证组与非热证组比较,其外周血淋巴细胞中有105个已知miRNAs表达变化2倍以上,其中36个表达下调,69个表达上调;173个已知miRNAs表达变化1.3倍以上,其中101个表达下调,72个表达上调;
②热证组与正常组比较,其外周血淋巴细胞中有105个已知miRNAs表达变化2倍以上,其中70个表达下调,35个表达上调;173个已知miRNAs表达变化1.3倍以上,其中98个表达下调,75个表达上调;
③非热证组与正常组比较,其外周血淋巴细胞中105个已知miRNAs表达变化2倍以上,其中63个表达下调,42个表达上调;173个已知miRNAs表达变化1.3倍以上,其中87个表达下调,86个表达上调。
4、实时荧光定量PCR结果与芯片结果部分一致。同时发现miR-181d、miR-181c、miR-424水平与火热证评分均呈显著的正相关(P<0.05);miR-181d水平与NIHSS评分呈显著的正相关;miR-181c、miR-424.水平与NIHSS评分无明显的相关性;而miR-212、miR-532-3p、miR-99a、miR-99b水平与火热证评分、NIHSS评分均无显著的相关性。提示火热证评分这种辨证分型的方法,有分子水平的变化支持。
5、从急性脑梗死热证、非热证之间的差异mi:RNAs筛选出30个差异显著的miRNAs,并对其中前8个:has-miR-181c、has-miR-181d、has-let-7f-1*、has-miR-212、has-miR-99a、has-miR.99b、has-miR-532-3p、has-miR-221,进行靶基因预测、查阅文献,发现大多与凋亡、炎症反应、血管损伤及再生等相关,其中miRNA-212可能跟梗死部位有关。
结论:
1、miRNAs在外周血中稳定存在,且其表达在急性脑梗死的病理过程中发生了显著的变化。有潜力作为缺血性脑血管病中西医结合辨证分型的新的生物标记物或特异性诊断指标。
2、首次从miRNA角度探讨急性脑梗死热证、非热证之间的差异,两者之间miRNA的表达谱有显著差异,对其中前8个miRNAs进行靶基因预测、查阅文献,发现与凋亡、炎症反应、血管损伤及再生等相关,可以用于解释一般热证患者较非热证患者病情重、炎症因子高等现象;筛选出1个miRNA分析可能跟梗死部位有关。研究结果可为将急性脑梗死分为热证、非热证两个基本证型并进行中西医结合治疗提供分子生物学的理论依据。