背景增生性瘢痕是创伤愈合后最常见的并发症之一,是人体对创伤的一种过度的愈合反应导致以成纤维细胞异常增殖、胶原大量合成、胶原过度沉积为组织学特点的皮肤纤维增生性疾病。据统计,国人烧伤后增生性瘢痕的发生率为91.4%,烧伤创面愈合时间若超过2周,增生性瘢痕发生率高达74.67%,远高于国外报道的38.00%。瘢痕形成后影响患者的容貌,并伴有痒痛,而且产生的挛缩可导致不同程度的功能障碍,如肌腱挛缩、关节脱位、运动功能障碍、职业心理障碍等,降低了该类患者的生活质量,为后期治疗带来沉重经济和心理负担。增生性瘢痕的防治研究是一个既古老又新颖的课题。由于发病机制尚未完全阐明,目前其治疗仍是临床上颇为棘手的难题。多年来国内外学者对增生性瘢痕的发生、发展及消退的机理进行了多角度、多层面的深入研究,但直至目前对其机制的研究尚无明确的结论,防治方面也尚无良方,较一致的看法有：①增生性瘢痕主要的效应细胞是成纤维细胞,并以细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为特征；②胶原代谢紊乱是其主要的生物学层面表现；③TGF-β1/Smad信号通路与成纤维细胞的增殖、分化、迁徙、凋亡及胶原代谢等多种生理、病理过程密切相关,Smads根据不同分型,对成纤维细胞胶原代谢具有双向调控作用。压力治疗增生性瘢痕早在400多年前就已有报道,随后众多学者进行多中心、大样本、随机对照临床试验业已证实压力在烧(创)伤后瘢痕的控制和预防中发挥着重要的作用。自70年代开始,压力疗法被广泛医生所接受,并得以推广和应用,目前压力治疗已成为增生性瘢痕的标准和首选治疗方法。但压应力治疗增生性瘢痕疗效都是基于临床经验,目前对压力治疗增生性瘢痕的机理认识还不是十分清楚。已有研究提示瘢痕形成的主要原因之一是成纤维细胞的胶原合成代谢和分解代谢的失衡,而这二者力量的消长及对比可能正是决定伤口愈合和组织重建的关键。压力治疗后创面不长瘢痕或瘢痕萎缩,分析其原因可归纳如下：促瘢痕形成因素水平下降；抑制瘢痕形成因素水平的增高。其中信号通路的调控分为三个水平：细胞外刺激信号分子作用；细胞内相应传导信号分子传递；靶基因转录、翻译。多年来许多学者的研究结果证实：成纤维细胞生物学行为,尤其是胶原代谢的改变在压力治疗增生性瘢痕过程中起主要作用。既往压应力治疗增生性瘢痕研究往往集中在增生性瘢痕的血供改变上,认为压应力使组织血流淤积,局部缺血或淤血,组织氧分压降低,从而抑制瘢痕的继续增长。然而,对于压应力是通过什么样的机制影响了成纤维细胞的生物学行为及其胶原代谢知之甚少。同时,以往的研究证实TGF-β1可以在转录和翻译水平上诱导MMP-1和TIMP-1的表达对胶原代谢产生影响。结合以往已有研究结果证实创伤后增生性瘢痕组织中TGF-β1呈增高趋势,Smad7较正常皮肤组织含量低,随着瘢痕的成熟组织中Smad7含量明显增高,我们联想到压力治疗增生性瘢痕其机制可能和TGF-β1/Smad信号转导通路中抑制中间分子Smad3的活化或上调smad7有关,进而调节MMPs表达而对胶原合成与降解产生影响。近些年来,研究机械应力作用于活体细胞,观察其受应力作用后的细胞形态、结构、功能状态、增殖、分化及凋亡等各种变化,是细胞生物学研究领域发展十分迅速的研究方法,并已证明机械应力在某些生理和病理过程中起着重要作用。因此,如果以瘢痕形成的效应细胞一成纤维细胞为研究对象,从影响其胶原代谢的Smads动态变化方面着手,以重要信号转导通路TGF-β1/Smads的作用为研究主线,研究压力作用后该通路对成纤维细胞生物学行为及胶原代谢平衡的调控机制,就有可能抓住压力作用促使增生性瘢痕迅速向萎缩性瘢痕发展的关键环节。检索文献少见有关压力干预下细胞因子表达改善成纤维细胞胶原代谢平衡紊乱调节的分子机制研究,本实验首次采用离体压力模拟技术以增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象,通过压力加载系统作用前后细胞内分子环境中Smad3和Smad7基因的表达与胶原代谢之间的动态关系,寻找通路中间分子与胶原代谢改变之间可能存在的压力效应分子；其次利用RNAi技术阻断关键性的中间分子Smad3,观察通路中间分子及胶原代谢的改变,确定信号传导通路中的Smad3分子对瘢痕成纤维细胞胶原代谢的影响；通过上述实验希望获得TGF-β1l/Smad信号通路对胶原代谢平衡的调节分子作用点,为压力治疗增生性瘢痕的部分机制提供有价值的实验依据,进而初步阐明细胞重建机制及信号传导通路调控的力学效应,并丰富相应的理论,为创伤愈合后如何减少瘢痕或无瘢痕的探索开拓新的途径。研究目的：1、为压力治疗增生性瘢痕的部分机制提供有价值的实验依据,初步阐明机械性压应力通过TGF-β通路治疗增生性瘢痕的分子机制。2、初步阐明Smad3基因对增生性瘢痕形成中的作用,进一步完善TGF-β1/smad信号通路在增生性瘢痕中的相关理论,为基因治疗增生性瘢痕提供分子靶点和一定的理论依据。研究方法：1、标本收集、处理12例增生性瘢痕标本及3例正常皮肤标本,年龄20岁到60岁,收集时间为2012年3月至2012年10月,分别来自广东省第二人民医院和广州市红十字会医院,标本的获取均征得病人的同意,签知情同意书。标本入选标准为：A、经临床医生鉴定为增生性瘢痕组织；B、排除垂体、肾上腺疾病、传染病、皮肤病及免疫性疾病患者,排除局部感染、溃疡患者；C、未接受任何治疗。手术室无菌条件下组织切取后,放于无菌的容器中,均于2小时内进行实验。2、体外培养正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞并鉴定在手术室无菌条件下,将切取的新鲜皮肤、增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩组织,4h内带回无菌工作间。将组织转入超净台中,1%双抗的生理盐水反复冲洗,尽量去除血污。眼科剪修除表皮和皮下组织后用反复剪切,使之成0.5～1mm3大小组织块。吸取组织块接种于40m1培养瓶瓶壁上,组织块间留约0.3-0.5cm的间距。密闭培养瓶,放入37℃、5%C02的电热恒温培养箱内3.5h。待培养的组织小块微干涸,取出培养瓶,向瓶底轻轻注入含RPMI1640+15%FBS培养液5m1,然后缓缓翻转培养瓶,让培养液慢慢覆盖附于瓶壁上的组织小块,尽量避免晃动培养瓶。翻转后,置于37℃、含5%CO2的电热恒温培养箱内培养。一周后取出培养瓶,移除瓶内培养液,生理盐水漂洗两次后加含RPMI1640+15%FBS培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后,同样方法每周换液两次。倒置相差显微镜观察其细胞萌出、细胞形态、生长增殖等情况,待原代培养细胞生长基本融合成片时即可常规传代培养,每周换液两次,待细胞融合成单层再次传代。本实验均在第4-8代进行。通过细胞免疫组化a-SMA染色进行细胞鉴定：将细胞培养在清洁灭菌的盖玻片上,经常规固定、脱水、抗原修复、过氧化氢灭活内源性酶,10%山羊血清封闭30min并滴加一抗1：100稀释的a-SMA(1：100稀释)4℃孵育过夜。洗涤3次后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, DAB显色。用PBS代替一抗做阴性对照。显微镜下观察细胞中阳性细胞的百分比。3、机械性压力干预将增生性瘢痕成纤维细胞样本(n=12)分为空白对照组和压力刺激组,每组6个样本。首先将样品加入进行样本孔中,然后按照仪器FX-4000C的说明书,安装压缩平板,并装在压缩系统的夹紧装置上,然后设置系统的参数：33Hz,35mmHg动态性压应力,过夜,24小时后取出细胞培养盘,进行后续实验。本实验全过程均是在特制的37℃,5%CO2的恒温培养箱中进行的。。4、通过GenBank查找TβRⅡ、smad3.smad7、MMP1、MMP2、MMP9、MMP12、Collagen Ⅰ、collagenⅢ基因序列,使用软件Primer-Express5.0进行引物与探针的设计。5、应用荧光RT-qPCR技术检测并比较空白对照组和压力刺激组TGF-β1受体、smad3、smad7、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表达量。常规Trizol试剂抽提总RNA,并鉴定其浓度、纯度及完整性。取总RNA1μg加入无菌蒸馏水12μl,混匀后65℃孵育5min,随后立即置于冰上；将配置好的变性退火反应液加入到含总RNA的溶液中混匀,在PCR仪上进行PCR反应,所得cDNA置于-20℃保存备用。以cDNA为模板,进行cDNA PCR反应及荧光定量PCR反应,设定cDNA PCR反应条件：预变性95℃3min,变性95℃40s,退火57℃50s,延伸72℃50s,延伸：72℃10min。荧光定量PCR反应条件为：93℃3分钟,然后93℃30秒,55℃45秒,72℃45秒,共40循环。6、将增生性瘢痕成纤维细胞样本(n=12)随机分为空白对照组和smad3阻断组,每组6个样本。应用si RNA技术,取100nmol Smad3si RNA,在核酸转染试剂Lipofectamine2000的介导下转染到增生性瘢痕成纤维细胞中,阻断smad3基因,并应用荧光RT-qPCR技术检测并比较空白对照组和smad3阻断组MMP1、 MMP2、MMP9、MMP12、Collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表达量。结果：1、空白对照组和压力实验组TPRⅡ、Smad3、Smad7及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的差异性表达：根据荧光RT-qPCR结果,增生性瘢痕成纤维细胞系中压力实验组较空白对照组TGF-β受体表达量增高,Smad3、Smad7、Collagen Ⅰ表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05), collagenⅢ表达两组差异无统计学意义(P>0.05)。2、阻断Smad3基因实验组和空白对照组MMPs和胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ差异性表达。阻断Smad3基因后,增生性瘢痕成纤维细胞系中实验组中MMP2、 MMP9、MMP12表达量较空白组表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05),而Collagen Ⅰ表达量较阻断基因前表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05),两组的MMP1、collagen Ⅲ表达量两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、机械压应力治疗增生性瘢痕可通过TGF-β1/Smad信号转导通路中抑制smad3的表达从而促进Ⅰ胶原的降解,smad3可能是其关键的压力效应分子之一。2.Smad3抑制MMP2.MMP9.MMP12的合成,从而促进增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达,是增生性瘢痕TGF-β1/Smad信号转导通路中关键的促纤维化因子。3.Smad3可能是治疗增生性瘢痕的生物靶点之一。