论文部分内容阅读
弱精子症又称精子活力不足,主要表现为精子的运动能力低下。流行病学调查发现弱精子症占男性不育的15%～25%,而且呈现逐年上升趋势。因此,研究弱精子症的发生、发展对男性不育的临床诊疗具有重要意义。弱精子症致病因素较多,包括生殖道感染、精索静脉曲张、内分泌紊乱、基因表达异常等等。目前对弱精子症相关基因的研究表明编码精子鞭毛组成蛋白和能量代谢有关蛋白等基因表达异常可引起精子活力下降,而这些基因中部分为睾丸特异性表达基因。这说明睾丸特异性表达基因可能参与调控精子运动。TDRG1（Testis Development Related Gene 1）是本人一直参与研究的睾丸特异性表达基因（Gen Bank accession No.DQ168992）。前期我们已证实TDRG1是灵长类动物特有基因,其在小鼠和大鼠睾丸中无同源基因表达,而在猕猴和黑猩猩睾丸中有同源基因表达。同时我们发现TDRG1在人睾丸生精细胞胞浆中都有表达,且随着生精细胞越成熟,TDRG1的含量越丰富。由此我们初步假设TDRG1可能参与调控人成熟精子的功能。为了证明这一假设,我们进行了深入的研究。本课题获得国家自然科学基金资助（项目编号81501317和81871207）,课题由以下四部分组成。第一章睾丸特异蛋白TDRG1在人成熟精子中的表达与定位目的:明确睾丸特异蛋白TDRG1在人成熟精子中的表达与定位。方法:利用免疫组化染色、RT-PCR、Western Blot和免疫荧光方法明确TDRG1在人成熟精子中的表达与定位。结果:免疫组化染色的结果发现随着生精细胞的成熟,TDRG1的含量也越丰富;RT-PCR和Western Blot的结果显示TDRG1在人成熟精子中有表达;免疫荧光的结果证实了TDRG1主要定位在精子的尾部（包括中段、主段和末段）。结论:TDRG1蛋白在人正常精子中有表达,且定位在精子尾部,为今后研究TDRG1在人成熟精子中的功能提供了理论依据。第二章穿膜肽携带重组蛋白TDRG1成功导入人成熟精子第一节穿膜肽TAT能携带EGFP成功导入人成熟精子目的:验证穿膜肽TAT能携带重组蛋白EGFP进入人成熟精子中,且对精子无影响。方法:首先构建重组质粒p ET28a-TAT-EGFP和p ET28a-EGFP-TAT的原核表达载体,其次表达和纯化融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT,最后将融合蛋白与正常人精子孵育,在荧光显微镜下观察融合蛋白的穿膜情况和精子运动参数的变化情况。结果:已成功构建了高表达重组质粒p ET28a-TAT-EGFP和p ET28a-EGFP-TAT表达载体,并表达和纯化了融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白与精子孵育后荧光显微镜下观察到精子内有绿色荧光,精子的存活率及运动参数无明显影响。结论:穿膜肽TAT能将融合蛋白EGFP顺利导入精子中,且对精子无明显毒副作用,为精子胞浆蛋白研究提供了实验基础。第二节穿膜肽TAT能携带TDRG1成功导入人成熟精子目的:验证穿膜肽TAT能携带重组蛋白TDRG1进入人成熟精子中,并观察其穿膜效果。方法:首先构建重组质粒p ET28a-TAT-TDRG1的原核表达载体,其次表达和纯化融合蛋白TAT-TDRG1,最后将融合蛋白与正常人精子孵育,借助flag tag抗体和TDGR1抗体结合Western Blot方法检测TAT-TDRG1的穿膜情况和最适浓度。结果:已成功构建了高表达重组质粒p ET28a-TAT-TDRG1,表达和纯化了的融合蛋白TAT-TDRG1。Western Blot检测结果证实外源TDRG1已成功导入人精子内,且80μg/ml为最适穿膜浓度。结论:穿膜肽TAT能把融合蛋白TDRG1顺利导入人成熟精子中,为今后研究TDRG1在人成熟精子中的功能提供了实验基础。第三章TDRG1蛋白与弱精子症的相关性目的:初步探明TDRG1蛋白与弱精子症的相关性。方法:利用RT-PCR和Western Blot从核酸、蛋白水平阐明TDRG1与弱精子症的相关性;同时利用第二章制备的融合蛋白TAT-TDRG1,将其与弱精子症精子样本孵育,比较添加融合蛋白前后精子活力的变化,正面来评价TDRG1蛋白在弱精子症精子中的功能,进一步明确TDRG1与弱精子症的相关性。结果:核酸和蛋白水平的TDRG1在弱精子症精子中均下降;免疫荧光结果显示TDRG1在弱精子症精子中分布减少甚至消失。TDRG1含量与精子前向运动率线性正相关。融合蛋白TAT-TDRG1导入精子后不仅能增加正常人的PR值（增加约10%）,而且能显著增加弱精的PR（40%）。结论:TDRG1蛋白与弱精子症存在相关性,即TDRG1含量在弱精子症精子中明显降低,且与精子前向运动率线性正相关。融合蛋白TAT-TDRG1明显提升弱精子症精子的前向运动率。第四章TDRG1蛋白在弱精子症中作用机制目的:探索TDRG1蛋白在弱精子症中可能作用机制。方法:通过非标定量以及高分辨率液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学研究策略寻找TDRG1的可能相互作用蛋白,再利用免疫共沉淀技术验证TDRG1的可能相互作用蛋白质。结果:通过非标定量以及高分辨率液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学研究策略成功鉴定到5298个蛋白质,以差异倍数值变化超过1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准找到632个差异蛋白,370例上调（其中与生殖相关蛋白41个）,262例下调（其中与生殖相关蛋白31个）。而表达下调的差异蛋白中我们分析预测CATSPER1与TDRG1存在相互作用。最后免疫共沉淀结果证实TDRG1与CATSPER1之间存在相互作用。结论:TDRG1可能通过CATSPER-Ca2+通路调控人精子运动。