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马铃薯Y病毒(PotatoVirus Y,PVY)是我国烟草PVY病害的主要毒源,其编码的基因组连接蛋白(viral genome-linked protein,VPg)参与病毒基因组的复制、翻译与病毒的移动,在病毒侵染过程中发挥着重要作用。本研究将马铃薯Y病毒VPg基因转化进烟草感病品种LJ925,初步观察了VPg在烟草中的亚细胞定位情况,并分析了转基因对烟草抗病性的影响。 本研究采用RT-PCR方法从感PVY病的烟草感病品种LJ925中克隆目的基因VPg,将其与pUCM18-T载体连接,通过测序验证VPg基因序列的正确性,利用 Gateway技术构建表达载体,电击法获得工程菌,叶盘法对烟草感病品种LJ925进行遗传转化,通过卡那筛选,获得95株卡那霉素抗性苗,从中选出50株进行PCR扩增检测,VPg基因转入烟草的阳性转化率为70%。在荧光显微镜下观察阳性转化株叶片下表皮的亚细胞定位情况,结果显示与阴性对照相比阳性转化株中的VPg-GFP融合蛋白主要集中在气孔内壁上。选取8株阳性转化株和1株阴性对照株,采用实时荧光定量PCR技术( real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测转化株中VPg基因的相对表达量,FQ-PCR结果显示,VPg基因的Ct值在20.94与28.90之间,对以上9株烟草通过机械摩擦接种PVY,在接种8d后阴性对照株开始表现出叶脉坏死的症状,编号为VPg93的转化株未表现病症(接种后第30d表现病症),其余转化株均与对照表现同样的病症,此时再对这9株植株进行 FQ-PCR,通过检测外源基因 hcp的相对表达量来反映PVY对烟草的侵染程度,FQ-PCR结果显示,与对照株中hcp的Ct值相比,除了 VPg93明显比对照株大外,其余的转化株均与对照株相差无几。对比接种病毒前后两次FQ-PCR的数据,分析结果表明除了编号为VPg93的转化株接种PVY后病症延迟外,马铃薯Y病毒VPg基因的遗传转化对其余转化株的抗病性没有影响。