近年来，以附睾蛋白酶抑制蛋白(epidydimal protease inhibitor，Eppin)为靶点的避孕疫苗研究取得了一定的进展，但仍存在以下问题：(1)采用Eppin优势表位疫苗进行免疫能减少不良反应，但免疫原性差；(2)表位交联载体蛋白可以增强免疫原性，但抗体特异性差；(3) Eppin避孕疫苗的实验研究中通常联合使用免疫佐剂如弗氏佐剂，其在人体中的应用存在安全性问题；因此，解决这一问题的关键在于构建更加安全、有效的避孕疫苗运载体系。本研究以筛选的优势表位为基础，设计构建多价表达抗原的E-Q11自组装纳米肽避孕疫苗，体外实验研究树突状细胞(dendritic cell, DC)对疫苗的摄取及免疫应答，建立避孕疫苗经皮微针免疫方法，对E-Q11自组装多肽的体内免疫效应和抗生育效应进行研究。课题分为三个部分。一、E-Q11自组装肽的构建及表征将前期筛选的Eppin优势抗原表位与具有多价抗原表达特征的自组装纳米肽(QQKFQFQFEQQ，Q11)进行偶联，采用人工合成肽技术固相合成融合多肽E-Q11，通过调整自组装条件制备E-Q11自组装纳米疫苗。结果表明，采用全化学合成方法获得的融合多肽E-Q11纯度大于90%，并能在PBS中完成自组装，圆二色谱分析E-Q11肽具有β折叠二级结构，透射电镜观察发现E-Q11肽能够自组装形成纳米纤维结构，ELISA实验证实E-Q11肽能与抗血清发生的结合反应。二、E-Q11自组装肽诱导小鼠骨髓树突状细胞的免疫应答分离培养小鼠骨髓树突状细胞(mouse bone marrow–derived DCs, mBMDCs)，加入不同浓度的E-Q11自组装肽和E肽进行刺激，观察mBMDCs吞噬及分析成熟表型；检测免疫小鼠脾脏CD4+T细胞与抗原负载DC共培养上清中的细胞因子。结果表明，通过双因子诱导法获得了CD11c表达率超过70%的DC；E-Q11自组装肽能被未成熟mBMDCs吞噬，DC成熟表型CD40和CD80表达明显增高；E-Q11自组装肽组的上清中IFN-γ较rhEppin组和E肽组明显降低，而IL-4高于其他两组，提示E-Q11自组装肽能够诱导Th2细胞极化。三、E-Q11自组装肽经皮微针免疫方法的建立及动物实验研究选择商品化微针构建抗原包被微针疫苗，建立避孕疫苗经皮微针免疫方法。选择C57BL/6小鼠进行免疫，具体分组为：抗原(E肽、E-Q11自组装肽和rhEppin)，免疫剂量(10μg和80μg)，免疫途径(微针(MN)和皮下(SC))，以及阴性对照组PBS共10组。ELISA监测免疫前后各时间点的抗体滴度及分析抗体亚型，ELISPOT分析Th1/Th2极化，合笼观察雌鼠受孕率及产仔率，检测附睾精子数、活力及低渗肿胀率。结果表明：1.500μm长度的微针适合用于小鼠微针免疫，荧光抗原包被的微针刺入小鼠皮肤能在60s内释放78%的抗原量，微针能有效包被上述三种抗原。2.除E肽免疫组和低剂量rhEppin皮下免疫组外，其余各组抗体滴度在初免后2周开始逐渐上升，于免疫结束后2~4周达到高峰，持续8~9个月。低剂量E-Q11自组装肽和rhEppin微针免疫比低剂量皮下免疫抗体反应强，与高剂量皮下免疫的抗体反应水平相似。提示E-Q11自组装肽能显著增强Eppin表位疫苗的免疫原性，避孕疫苗经皮微针免疫具有剂量节省效应。3.高剂量rhEppin皮下免疫组小鼠产生了高水平的IgG1和IgG2a抗体亚型，以及IFNγ分泌细胞。而E-Q11自组装肽免疫组和rhEppin微针免疫组小鼠的抗体亚型主要为IgG1。采用微针免疫时，各组小鼠IL-4分泌细胞增多而IFN-γ分泌细胞减少。采用皮下免疫时，E-Q11自组装肽免疫小鼠的IFN-γ分泌细胞明显低于rhEppin组。提示采用E-Q11自组装肽和经皮微针免疫途径能增强Th2型免疫反应。4. E-Q11自组装肽免疫组小鼠的生育力均受到抑制，其中微针组受孕率最低(20%)，而E肽免疫组小鼠受孕率均未下降，rhEppin免疫小鼠中，微针组与高剂量皮下组受孕率分别为26.6%和13.3%，而低剂量皮下组受孕率无明显下降。各组小鼠的生育力于36周后均得到恢复。各实验组与PBS对照组相比，精子计数无明显变化，而精子活力和HOS%显著下降。提示避孕疫苗经皮微针免疫与皮下注射相比能提高疫苗保护效率和生物利用度，E-Q11自组装肽纳米疫苗具有良好的安全性和有效性。