团头鲂(Megalobrama amblycephala),俗称武昌鱼,属于硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲌亚科、鲂属,是我国特有的优良草食性鱼类。目前对于鱼类的食性研究较少,有关鱼类食物的消化机制尚不明确,尤其是草食性鱼类,为什么草食性鱼类能够吃草而有些鱼类只吃活体小鱼小虾?草食性鱼类是如何消化和利用纤维素的?对于这一问题,本研究选取草食性的团头鲂为研究对象,通过对其全基因组进行测序、组装、注释及进化分析,全面解析团头鲂的基因组、基因集、SNP、非编码RNA等遗传信息及探究其草食性的适应性进化问题;另外,在基因组水平研究草食性的团头鲂以及其它食性鱼类的内源性消化酶、嗅觉受体及味觉受体基因家族的基因拷贝数变化以及在不同食性鱼类中的进化模式;深入研究与食性适应性进化相关的胰核糖核酸酶基因(RNase1)在团头鲂发育不同阶段及不同组织中的表达模式、消化功能以及抗菌功能等;此外,利用宏基因组测序的方法研究草食性的团头鲂以及其它食性鱼类的肠道微生物菌群组成、菌群丰度及与肠道内容物的酶活性之间的相关性。整个研究基于全基因组和宏基因组测序,将草食性的团头鲂及其它食性鱼类的内源性消化系统与外源性消化机制相结合,一方面阐明了草食性团头鲂的植食性机制,为后续团头鲂的营养学研究、微生态制剂的研发、抗病研究、分子育种及品种选育等方面提供了数据和理论支持,另一方面也为其它食性鱼类的食性研究及营养学研究奠定了基础。1.团头鲂全基因组测序及食性进化研究通过对团头鲂全基因组进行de novo测序、组装、注释及进化研究获得了团头鲂的全基因组与基因集数据。团头鲂基因组大小为1.116 Gb,测序覆盖度为130X,GC含量为37.3%,与鲤鱼(37.0%)和斑马鱼(36.7%)接近,组装得到contig N50长度为49 Kb,scaffold N50长度为839 Kb;团头鲂基因组注释得到23,696个蛋白编码基因,其中99%的基因都有转录组数据以及同源物种注释信息支持,另外注释得到1,408个非编码RNA,其中474 miRNAs,110 rRNA,530 tRNAs和294 snRNAs;团头鲂基因组中有34%的转座子序列(TE),其中DNA型转座子占23.8%,逆转座子LTRs占9.89%,与其他鱼类相比,团头鲂LTRs的比例最高;物种进化分析发现,团头鲂与草鱼的亲缘关系最近,推算的分歧时间为13.1百万年;草食性的团头鲂和草鱼祖先支扩张的基因家族主要与免疫、嗅觉受体、糖脂类物质代谢相关;与其他肉食性和杂食性鱼类相比,在草食性的团头鲂和草鱼同时受到正选择的基因家族中,有17个基因在糖代谢和脂肪代谢调控中起到关键作用。2.不同食性鱼类内源性消化系统比较研究对不同食性鱼内源性消化系统比较发现,草食性的团头鲂基因组中不存在内源性的纤维素消化酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡糖苷酶)基因,团头鲂对于食物中纤维素的消化可能主要依赖于其肠道微生物菌群;团头鲂的内源性淀粉酶(α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶)基因和蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶及糜蛋白酶)基因的拷贝数与肉食性鱼类相比没有明显的变化,说明团头鲂具有完善的消化碳水化合物和蛋白质的能力;团头鲂基因组中有179个完整的嗅觉受体基因,与其他鱼类相比数目最多,其中β亚型在团头鲂和草鱼中显著扩张;不同食性的几种鱼鲜味、甜味及苦味受体基因拷贝数和进化方式明显不同,其中草食性的团头鲂体内缺少鲜味受体t1r1基因,说明其可能失去对鲜味感知的能力,而甜味受体基因(t1r2)和苦味受体(t2rs)基因的拷贝数较多;相反的,在肉食性鱼类中,鲜味受体基因扩张,甜味和苦味受体基因收缩或者缺失。3.团头鲂rnase1生物学功能研究胰核糖核酸酶rnase1是由动物胰脏分泌的重要的消化酶,与草食性动物的食性适应性进化有关。本研究在团头鲂、草鱼、鲤、斑马鱼和青鳉基因组数据中分别鉴定出了其rnase1基因且都是单拷贝。多序列比对发现这5种鱼类的rnase1具有哺乳动物rnasea超家族的特征:n端有信号肽序列,有“ckxxntf”特征motif序列,含his12–lys41–his119催化位点及6个保守的半胱氨酸残基;基因表达模式研究表明,团头鲂rnase1基因在胚胎发育早期不表达,但在受精后120和144h有表达,在一龄和二龄团头鲂的不同组织中表达模式明显不同,其中在一龄鱼中主要在肝脏和心脏中表达,其他组织均不表达,而在二龄中除了心脏和肌肉外,在肝、脾、肾、脑、肠道及性腺中均表达;实验获得了团头鲂rnase1重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达;蛋白生物学功能研究发现,团头鲂rnase1蛋白不仅具有较强的消化活性,还具有抗菌活性,对革兰氏阴性菌和阳性菌均有明显作用。4.不同食性鱼类外源性消化系统比较研究为了明确草食性的团头鲂和其他不同食性鱼类肠道微生物的差别,本研究基于高通量测序的方法研究了同一水域的四种不同食性的八种鱼肠道微生物菌群组成与丰度的关系。24个测序文库共获得了985,356条高质量序列,7,349个OTUs,共包含了53个细菌门;PCoA分析发现由于食性的不同,草食性和肉食性鱼类明显聚为两个群;四种食性鱼共有的核心菌群比例较大(18.01%),在门水平,优势菌群分别为变形菌门、后壁菌门、梭菌门和酸杆菌门,但四种菌群相对丰度有所差别;在属水平,草食性的团头鲂和草鱼肠道微生物中纤维素降解菌群比例最高(>7%),主要为梭菌属、柠檬酸杆菌属、纤毛菌属及链球菌属;在肉食性鱼类中该菌群比例只有2%,而相对丰度最高的菌群主要为鲸杆菌属和盐单胞菌属;在杂食性和滤食性鱼类中,梭杆菌属、鲸杆菌属及盐单胞菌属相对丰度均较高;草食性鱼类的肠道内容物的纤维素消化酶和淀粉酶活性显著高于肉食性鱼类,而肉食性鱼类肠道内容物的胰蛋白酶活性显著高于草食性和滤食性鱼类。这说明鱼类肠道微生物的菌群组成与丰度及肠道内容物酶活性明显受其食性的影响,草食性鱼类中的纤维素菌群在草食性鱼类食物消化中可能扮演着极为重要的作用。