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大豆原产于中国,栽培历史悠久,是蛋白质和油料的主要来源之一。干旱、盐害等非生物胁迫对大豆的生产影响较大,因此,开展大豆抗旱胁迫相关基因的功能研究,对揭示大豆抗旱机理、培育大豆抗旱品种具有重大的理论和应用价值。本研究构建了CRISPR/Cas9基因定点突变体系,以期利用此体系对大豆基因与mi RNA家族各成员功能进行研究。深入地分析了大豆抗旱相关gma-mi R160的功能,为揭示大豆抗逆的分子机理和抗旱新品种培育提供相关重要信息。本研究取得的主要研究结果如下:1大豆CRISPR/Cas9基因定点突变体系的构建。在大豆全基因组水平上预测了10个可能具有转录活性的U6启动子,分别构建了以大豆U6-10与拟南芥U6-26启动子驱动sg RNA的两类CRISPR/Cas9载体:p Cas9-Gm U6-sg RNA与p Cas9-At U6-sg RNA。选取3个大豆基因glyma06g14180、glyma08g02290与glyma12g37050为目标基因,通过转化大豆原生质体与大豆子叶节毛状根方法,统计并比较了两类CRISPR/Cas9体系对目标基因的编辑结果。结果发现将CRISPR/Cas9体系转化大豆原生质时,目标基因序列内单碱基突变的概率较高,而转化大豆子叶节毛状根时更易产生碱基缺失突变类型。根癌农杆菌注射大豆子叶节诱导毛状根法表明,转化p Cas9-Gm U6-sg RNA载体时,目标基因靶位出现的突变概率显著高于转化p Cas9-At U6-sg RNA载体,突变率分别为14.7–20.2%与3.2–9.7%。同时,研究还发现无论是PEG转化大豆原生质体还是根癌农杆菌侵染大豆子叶节发根法,CRISPR/Cas9基因定点突变体系均存在脱靶效应。以上结果表明利用CRISPR/Cas9体系可以对大豆基因进行定点编辑,对研究大豆基因、尤其是与根发育相关基因的功能提供了较好的研究方法。2初步研究了利用CRISPR/Cas9基因定点突变体系获得ath-mi R160家族各成员突变体。根据拟南芥ath-mi R160家族3个成员(ath-mi R160a/b/c)的前体序列,分别设计了特异的sg RNA引导序列,通过T7 RNA聚合酶体外转录生成sg RNA,利用Cas9核酸酶体外切割方法证明了CRISPR/Cas9体系均能切割包含ath-mi R160a/b/c前体序列的DNA片段。通过转化拟南芥原生质体发现利用CRISPR/Cas9体系获得了含有单碱基突变的ath-mi R160c前体序列。结果表明利用CRISPR/Cas9体系可能获得分别针对于ath-mi R160a/b/c前体的碱基突变体,为研究拟南芥ath-mi R160及其他mi RNA家族各成员功能的异同奠定了基础。3大豆抗旱相关gma-mi R160的功能研究。预测了大豆gma-mi R160的12个靶位,利用RNA-ligase-mediated Rapid Amplification of c DNA Ends(5’RLM-RACE)方法确定了受gma-mi R160调控的11个靶位的精确切割位点,切割位点主要集中在与gma-mi R160成熟序列互补位置的第10或第11个碱基处。利用烟草幼嫩叶片瞬时表达方法再次证明了glyma04g43350.1、glyma10g35480.1及glyma19g36570.1基因受gma-mi R160的调控。q RT-PCR结果表明gma-mi R160及其靶位glyma10g35480.1具有时空表达性模式且响应干旱胁迫应答。通过对转化大豆gma-mi R160a前体(gma-MIR160a)的转基因拟南芥纯合系的干旱响应分析发现,转gma-MIR160a拟南芥的植株与野生型相比,在含有100 m M甘露醇的MS固体培养基上其根系生长受到抑制。经干旱—复水处理发现,与野生型拟南芥相比,转基因系植株出现萎蔫现象较早,复水后恢复绿色的速度较慢,表明大豆gma-mi R160可能是干旱敏感型基因。此研究结果在mi RNA响应干旱胁迫方面具有重要的参考价值。