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一、研究背景癌症是一个全球死亡的主要原因,中国每年有超过160万人被诊断为癌症,120万因癌症而死亡。乳腺癌是欧美国家女性最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率逐年上升。因此,探明乳腺癌的发生发展机制,找到安全有效的诊断和治疗方法对乳腺癌的治疗和预后有着重要的作用。近年来,一群小分子非编码单链RNA(miRNAs,microRNAs)成为了研究热点。miRNAs通常调控多个或一组具有相似功能的靶基因,在调控细胞生物功能中具有重要作用。已有研究证实mi RNAs在乳腺癌的基因调控中发挥重要作用。二、研究目的基于现有的关于乳腺癌相关miRNAs和相关基因的文献报道,结合生物信息学技术分析,本实验拟通过预测出乳腺癌相关的miRNAs,验证它们在乳腺癌细胞模型中对增殖、侵袭和迁移能力发挥的作用,并查找出相关的靶基因。在探明机制的同时,可望为乳腺癌的诊断和治疗提供新的方法和新的治疗靶点,为增强治疗效果和改善预后研究提供一定的理论依据。三、研究方法1.在前期乳腺癌和乳腺癌干细胞miRNAs表达谱的基础上,利用乳腺组织特异性分析、显著靶向性功能分析(Gene Ontology,GO-analysis)、靶基因分析等生物信息学方法,建立乳腺癌miRNAs调控网络(mi RNAs-Gene network和miRNAs-GO-network),利用图论方法筛选出在乳腺癌恶性表型调控中可能起着关键作用的miRNAs分子。2.以MCF-7和T47D乳腺癌细胞为实验对象,进行miRNAs激动剂和miRNAs抑制剂进行转染,通过transwell-侵袭、transwell迁移、划痕、Brdu增殖等实验方法,研究miRNAs对乳腺癌细胞侵袭、迁移、增殖能力的影响。3.利用TargetScan和miRanda等在线工具,预测miRNAs靶基因,利用运用western blot技术对miRNAs转染的细胞中靶基因的表达进行验证。四、研究结果1.miRNAs-Gene network和miRNAs-GO-network显示,miR-106a和miR-20b均具有最高的调控维度,并且其均位于X染色体上(Xq26.2,GRCh37),相距不足10kb,是一个新型的miRNA cluster,可能是调控乳腺癌恶性表型的关键分子。2.miR-106a抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移,具有抑癌基因的作用;miR-20b促进乳腺癌细胞的迁移,具有促癌基因的作用。3.以癌细胞增殖、分化为基础,以结合自由能为标准,获得18个miR-106a/20b的候选靶基因,经qRT-PCR初筛和靶基因功能分析,选定CCND1和E2F1两个潜在靶基因进行验证。以MCF-7细胞为实验体系,western blot和双荧光素酶报告基因系统进行靶基因验证,结果显示:CCND1和E2F1是miR-106a的靶基因,miR-106a可直接抑制CCND1和E2F1表达;CCND1和E2F1不是miR-20b的靶基因,miR-20b间接促进CCND1和E2F1表达。五、结论1.结合基因芯片与显著靶向性功能分析的生物信息学技术,有助于发现在乳腺癌恶性表型调控中发挥重要作用的miRNAs分子及其靶基因。2.miR-106a和miR-20b作为新型的miRNA cluster,对乳腺癌恶性表型分别起着抑癌基因和癌基因的作用,在乳腺癌发生发展中起着平衡作用。3.miR-106a的抑癌作用是通过对靶基因CCND1和E2F1的直接负向调控而实现的,miR-20b的促癌作用则是对CCND1和E2F1的间接正向调控而实现的。