ARA290是一种由促红细胞生成素受体结合结构域B螺旋衍生出的多肽物质。研究报道表明,ARA 290在许多临床应用中是有益的,例如糖尿病和结节病。ARA 290能够保护组织免受损伤并修复受损的组织,这可能是由于ARA 290能够特异性靶向先天性修复受体(innate repair receptor,IRR)并下调损伤部位的炎症反应。在对ARA 290进行动物毒性和人类患者临床评估时,目前认为ARA 290是安全无副作用的。由于ARA 290的半衰期短,这在很大程度上减少组织、暴露于高浓度药物的环境下。特别是,最近的研究表明ARA 290能够改善神经病症状并缓解神经性疼痛。神经性疼痛是体感系统中的疼痛纤维由于疾病或组织损伤而受到影响的病症,通常包括痛觉过敏和异常性疼痛。痛觉过敏的特征在于疼痛敏感性升高,而异常性疼痛的特征在于对通常非疼痛性刺激的疼痛反应。常见的导致神经性疼痛的疾病主要包括脊髓损伤、多发性硬化和糖尿病等,以及癌症和用于治疗癌症的化学疗法。在外周体感系统中,神经性疼痛通常由致敏的疼痛纤维引起异常的自发性损伤后活动引起。在中枢神经系统中,神经性疼痛的机制更复杂,可能涉及通过N-甲基-d-天冬氨酸(N-methyl-d-aspartate,NMDA)亚基的磷酸化从而增加脊髓神经元的敏感性,以及降低中间神经元的抑制作用。除了神经系统的异常外,炎症在提高和维持神经病理性疼痛方面也起着重要作用。通常认为ARA 290通过靶向IRR受体来抑制炎症,从而缓解神经性疼痛。然而,ARA 290介导的镇痛作用是否涉及其他机制或途径仍然不得而知。免疫系统目前已被证明对疼痛传递有许多影响,一些免疫分子可直接激活外周疼痛纤维。这些最新发现鼓励我们推测ARA 290可能对瞬时受体蛋白通道(transient receptor protein channels)有直接作用,如 TPRV1-4,TPRM8 和 TRPA1,这是大多数疼痛感知的原因。在周围神经系统,TRPV1主要位于脊髓背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)及脑三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)中被称为伤害性感受器的中小型神经元中。而这些小直径神经元大部分与细的有髓鞘的Aδ纤维或无髓鞘的C纤维相连,因而认为其与痛觉传递关系密切。TRPV1与capsaicin特异性结合,被激活后优先允许钙离子通过其离子通道,引起细胞内钙离子浓度升高,钙离子浓度升高进而引起P物质(substance P,SP)以及降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)等神经肽类和兴奋性氨基酸的释放,进而产生疼痛。基于上述研究,我们提出,免疫介质ARA290是否通过阻断或影响疼痛感受体来直接靶向外周伤害感受器,即ARA290是否通过直接作用于神经元TRPV1受体产生镇痛作用。本研究中,我们采用DRG神经元和TG神经元的capsaicin诱导模型,通过使用钙成像,细胞培养和行为测试等方法,探讨免疫介质ARA290预处理是否降低capsaicin诱导DRG神经元和TG神经元的反应,以及该作用是否通过TRPV1受体介导。第一部分免疫介质ARA290预处理通过提高TRPV1受体反应阈值来降低capsaicin诱导的神经元反应实验目的:探讨免疫介质ARA290预处理是否降低capsaicin诱导背根神经元和三叉神经元的反应,以及该作用是否通过TRPV1受体介导。实验方法:采用DRG神经元和TG神经元的capsaicin诱导模型,通过使用钙成像和细胞培养等方法来研究,具体实验方法如下:1.解剖并分离出小鼠的背根神经节(DRG)和三叉神经节(TG)中的神经元细胞,加入钙离子指示剂Fluo-4 AM染色液染色后,用激光共聚焦显微镜来测量神经元对各种刺激的荧光信号强度,包括ARA290、capsaicin和KCI溶液。将100个DRG神经元和TG神经元均相应分成四组,分别为Cap组,Cap+A组,KCI组,以及KCI+A组,每组25个细胞。Cap+A组和KCI+A组的细胞:3 nM ARA 290进行预处理,之后分别加入3 μM Capsaicin和50 mM KCI;Cap组和KCI不进行预处理,分别加入3 μM Capsaicin 和 50 mM KCI。2.用分离出的DRG神经元测试温度感知受体的激动剂,在单独使用激动剂和同时施加3 nM ARA290的两种情况下,我们在10个神经元细胞中记录每一次刺激的钙离子信号反应。激动剂包括:TRPM5的激动剂100μM的薄荷醇,TRPA1的激动剂10μM异硫氰酸烯丙酯(AITC),TRPV2、3的激动剂 100 μM 2-APB,TPRV4 的激动剂 1 μM GSK1016790A3.将分离的DRG和TG神经元用fluo-4 AM进行染色,然后施加不同浓度梯度的Capsaicin溶液,浓度从0.1 μM到10 μM。然后把相同浓度的capsaicin&溶液与3种不同浓度的ARA290(0.3 nM,1 nM和10 nM)溶液混匀后施加于其他组的DRG神经元和TG神经元细胞溶液中。根据均一化的数值,我们绘出了 ARA290对Capsaicin作用影响的浓度曲线。4.在HEK293细胞中过量表达TRPV1通道基因,这种表达TRPV1蛋白的细胞同时还会表达mCherry蛋白作为报告基因。我们用fluo-4 AM对细胞进行染色,并且检测他们对10μM Capsaicin和3 nM ARA 290引起的钙离子信号反应。实验结果:1.ARA 290预处理特异性地抑制了由capsaicin诱发的背根神经节和三叉神经节的神经元反应:单个DRG神经元与TG神经元,均对50 mM KCI和3 μM Capsaicin刺激出现了钙离子反应信号,但是加入ARA290可以特异性地抑制capsaicin诱发的DRG神经元与TG神经元的钙离子反应。检测多个样本神经元capsaicin诱发的DRG神经元与TG神经元的钙离子反应时,同样发现ARA 290预处理特异性抑制Capsaicin诱发的DRG神经元和TG神经元的钙离子反应。然而,无论是在单个神经元还是在增加了样本量之后,由KCI去极化作用所引起的钙离子信号反应在背根神经元和三叉神经元中均没有受到明显抑制。因此,推测ARA 290可能特异性的靶向结合于TPRV1通道Capsaicin受体。2.ARA290特异性靶向结合TRPVI通道降低capsaicin反应:实验中没有发现ARA290可以显著性地抑制或者提高任何激动剂激发的反应,表明我们发现ARA290可以特异性的抑制TRPVI通道但同时又不会影响其他热感受器。3.ARA290提高了 TRPV1通道对Capsaicin反应的阈值:在DRG和TG神经元中都观察到施加ARA290后Capsaicin原始的浓度曲线发生了向右偏移,而且它还可以增加TRPV1通道对Capsaicin的反应阈值,并且这个效应是剂量依赖性的,高浓度的ARA290会将阈值提的更高。同时与单独施加Capsaicin相比,当在有ARA 290存在的情况下Capsaicin的EC50数值变大,这表明ARA 290可能是Capsaicin的一种竞争性拮抗剂。4.ARA290可以剂量依赖性地抑制Capsaicin反应:10 μM Capsaicin引起了 HEK293细胞强烈的钙反应,而同时对细胞施加10 μM Capsaicin的同时加入不同浓度的ARA290溶液(从0.1 nM至10 nM),结果发现ARA290能够抑制Capsaicin引起的钙离子信号反应,并且这种抑制作用呈现出浓度依赖性,半数最大抑制效应浓度(IC50)大约在1 nM。这表明ARA290抑制TRPVI过表达HEK293细胞的Capsaicin激发的钙离子信号反应具有剂量依赖性的特征。实验结论:1.在单个DRG神经元和TG神经元细胞中,ARA 290能够特异的抑制由capsaicin诱发的TRPV1通道介导的神经元反应,这种抑制作用与KC1引起的TRPV1的去极化过程无关,与其它热感受器无关;2.在多神经元细胞实验和HEK293细胞系中,ARA 290都能够特异的抑制capsaicin对TRPVI通道的激发作用,并且这种抑制作用呈现剂量依赖性;3.ARA290的存在能够提高TRPV1通道的反应阂值,ARA290与capsaicin之间存在着竞争性拮抗作用,是TRPV1的拮抗剂。综上所述,我们的研究表明ARA 290可能成为TRPV1通道的新型拮抗剂。第二部分ARA290通过靶向结合TRPV1通道可以缓解神经病理性疼痛实验目的:利用capsaicin诱导小鼠疼痛模型来观察免疫介质ARA290是否可以缓解疼痛及痛觉过敏,以及这种缓解作用是否呈剂量依赖性。实验方法:在活体小鼠capsaicin诱导模型上,使用缩足反射阈值和缩足反射频率分析方法,具体如下:1.缩足反射阈值分析:将小鼠随机分为3组,每组8只分别皮下注射1 nM ARA 290,10 nM ARA 290和10 μLPBS,注射部位在左侧后肢足底部位。注射15分钟后,这些小鼠分别皮下注射10 μM capsaicin溶液,然后放回到笼中。对照组的小鼠仅仅注射10 μL生理盐水后放回观察笼中。30分钟后,通过动态足底触觉仪测试缩足反射阈值。将连接于仪器的von Frey金属丝置于小鼠后足腹部表面,启动仪器后金属丝上的刺激力量逐步增加直到测试小鼠产生缩足反射,记录数值。测试重复两次,并取平均值用于后续分析。2.缩足反射频率分析:对小鼠皮下注射10 μM capsaicin稀释液,以只注射等量的生理盐水小鼠作为对照组,注射部位位于左后肢足底部。注射15分钟后,将已经注射capsaicin的小鼠随机分成4组(每组8只),其中三组小鼠分别注射1 nM ARA290,10nMARA290和10μLPBS。之后将小鼠放在透明塑料盒内休息,在capsaicin注射后1、2、4、8、24小时后分别测量爪撤回频率。测试重复进行10次,其中正反应的百分比被用于数据分析。实验结果:1.ARA290抑制活体小鼠capsaicin诱导的缩足反射的压力阈值:注射capsaicin是机械性痛觉超敏反应的标志。单独只注射PBS没有提高缩足反射的阈值,与之相反,施加1nM和10 nMARA 290后可以显著的提高缩足反射的阈值,并且这种效果是呈现剂量依赖性的,1nMARA 290的处理只能轻度提高反射阈值,而10 nM ARA 290几乎完全抑制了capsaicin对缩足反射阈值的降低作用。2.ARA290抑制活体小鼠capsaicin诱导的缩足反射的频率:由capsaicin引起的痛觉超敏反应可以被ARA290部分的缓解,但是不能被PBS缓解,并且这种缓解作用也是剂量依赖的。实验结论:活体小鼠capsaicin诱导模型上的结果表明,ARA290可以通过拮抗TRPV1通道缓解capsaicin诱发的机械性超敏反应。