植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道，介导胞内或胞间的水分跨膜运输，并参与植物体的许多重要生理过程及逆境应答反应。本研究的主要目的是通过在烟草中正义和反义表达油菜种子萌发特异性表达的质膜水孔蛋白BnPIP1基因来探讨水孔蛋白在植物体内的水分运输功能及其在植物耐干旱胁迫中的意义。并通过克隆BnPIP1基因的上游调控序列初步研究了BnPIP1基因的时空表达模式。本研究为了解植物干旱胁迫下水分运输的调控机制提供了新的思路，也为进一步研究BnPIP1基因的表达特性奠定了基础。主要研究结果如下： 1．利用RT-PCR方法从油菜幼苗叶片总RNA中克隆出油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因的全长cDNA片段。该片段与文献报道的序列具有99％的同源性。存在4处碱基突变，仅导致一处氨基酸突变，推测为是物种内不同品种间的遗传差异。 2．以CaMV35S为启动子，以Tnos为终止子，分别构建了BnPIP1基因的正义和反义植物表达载体，用以研究BnPIP1基因在植物体内的生理功能。通过农杆菌介导的方法转化烟草叶盘。研究结果表明：异源反义表达BnPIP1基因，可以抑伟烟草内源水孔蛋白的表达，使植物水分运输能力明显下降。表现为叶肉原生质体在低渗溶液中处理2小时后才有80％会破裂，整株抗旱性弱。转正义BnPIP1基因的植株则通过增加外源水孔蛋白的含量实现了对水分运输快速灵敏的调控，表现为在低渗溶液中，90％以上的叶肉原生质体在5分钟内快速破裂，整株抗旱性强及T₀代种子在高渗土壤中萌发早而整齐。 3．转基因T₀代种子在含抗生素培养基上的萌发试验表明，不同转基因株系中外源基因的整合方式不同。有的株系外源基因以单拷贝或多拷贝的形式整合在一条染色体上，T₀代种子中外源基因呈现出近3：1的分离比。有的转基因株系中，外源基因以多拷贝的形式整合在不同的染色体上，T₀代种子中外源基因的分离比例比较复杂。 4．利用连接介导PCR的染色体步行技术，我们克隆了长为1610bp的油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因的上游调控序列。该序列存在着两个可能的TATA-box序列、一个G-box序列、4个TGAC序列、若干个TGAC-like序列及较多的AT丰富序列，这些顺势元件分别是RNA聚合酶Ⅱ、bZIP蛋白及AT丰富序列结合蛋白的识别位点，可能会在基因的转录与表达中起到调控作用。Blast分析表明，该序列为一新的调控序列，GeneBank上的登录号为AF472487。博士学位论文 中 文摘要 于秋菊5．利用双元植物表达载体 pBll21，pCAMBIA1305．1及专门用于检测启动子活性的 pPR97载体，构建了 BnPNI上游 1．6kb调控序列与牙m的融合基因。在含适当激素 的MS培养基上，再生小芽的组织化学染色表明，其驱动》份基因的表达强度与 pBllZI中 CaMV 355相当。GUS染色主要分布在水分需求量大的细胞迅速增生的部 位及运输水分的微管组织中。并初步推断该启动子可能具有种子萌发特异性。6．利用 PCR扩增技术，将 1．6kb的上游调控区从 5’端分别缺失 obp，580hp，708hp和 1246…，构建了四个双元表达载体p97－0，p97－580，p97－708和p97－1246。转化烟草 愈伤组织的 GUS染色结果初步将整个启动子分为 3个区段：区段 1，－16lffe－1030 hP， 是启动子的正调控区，能指导算m基因大量表达；区段 2，－103De－902 hp，可能含 有启动子的负调控元件，强烈J：llial4)制着算凹基因的表达；区段3，－902～－19 hp，该 区具有全长启动子片断同样的活性，亦可指导9吩基因的表达。