灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallen)是我国粮食作物上的一种重要害虫,它不仅刺吸取食禾本科植物造成虫害,还通过传播病毒而引起水稻、玉米、小麦等重要粮食作物的病毒病。2000年以前灰飞虱在我国只是零星发生,长期作为次要害虫对其进行防治。但自从2005年以来,该虫在我国许多地区特别是江苏、山东等省频繁暴发。长期大面积和不合理使用化学药剂导致灰飞虱抗药性的产生,灰飞虱对杀虫剂抗药性的产生是其近年来暴发频繁的主要原因之一。因此,必须加强灰飞虱的抗性治理,以期延缓其抗性进一步发展。明确杀虫剂的抗性机制是害虫抗性治理的前提。本文以灰飞虱室内抗药性筛选为基础,系统地研究了灰飞虱对毒死蜱和噻嗪酮的抗性生化、分子生物学机理。为更好地进行灰飞虱抗性治理和新药开发提供新的依据。一、灰飞虱抗毒死蜱品系的抗性筛选及生化机理研究经过对灰飞虱云南敏感品系(YN)连续32代的毒死蜱抗性筛选,与云南品系相比,毒死蜱抗性品系(YN-CPF)的抗药性上升到213.49倍；该抗性品系在连续12代无药剂筛选压力下其抗性衰退为83.08倍,以此作为抗性衰退品系(YN-DPF)。以YN, YN-DPF和YN-CPF品系为试虫,通过解毒代谢酶活力和增效剂生物测定分析,研究了灰飞虱对毒死蜱的抗性生化机理。分别在YN-CPF、YN-DPF和YN品系中测定了PBO、 DEM和TPP对毒死蜱的增效作用。结果显示在抗性和抗性衰退品系中,多功能氧化酶抑制剂PBO分别对毒死蜱有3.77倍和2.28倍的增效作用,谷胱甘肽S-转移酶抑制剂DEM对毒死蜱的增效作用分别为2.82倍和1.79倍,羧酸酯酶抑制剂TPP对毒死蜱的增效作用分别为4.31倍和2.59倍,三种增效剂在敏感品系中均未对毒死蜱表现出显著的增效作用。解毒代谢酶活力测定结果显示抗性品系细胞色素P450单加氧酶活力为敏感品系的0.67倍；谷胱甘肽S-转移酶活力在两品系间无显著差异；酯酶活力在抗性和抗性衰退品系中分别为敏感品系中的4.15倍和1.92倍。此外,抗性品系乙酰胆碱酯酶最大反应速率(Km)是敏感品系的2.56倍,亲和力及氧化毒死蜱抑制中浓度分别为敏感品系的1.81倍(Km-YN-CPF/Km-YN)和5.53倍(I50-YN-CPF/I50-YN)。以上结果说明,酯酶活性提高以及乙酰胆碱酯酶敏感性下降可能参与了毒死蜱的抗性形成,关于细胞色素P450单加氧酶和谷胱甘肽S-转移酶在毒死蜱抗性中的具体作用方式还需进一步研究。二、灰飞虱抗噻嗪酮品系的抗性筛选及生化机理研究对灰飞虱YN品系连续41代的噻嗪酮抗性筛选,获得了82.08倍的相对噻嗪酮抗性品系YN-BPF;对南京田间灰飞虱品系(NJ)连续12代的噻嗪酮抗药性筛选,与初始NJ和YN品系相比,获得的南京抗性品系(NJ-BPF)对噻嗪酮的相对抗性分别为4.46倍和96.58倍。以’YN-BPF、NJ-BPF品系和YN品系为试虫,通过解毒代谢酶活力和增效剂生物测定分析,初步研究了灰飞虱对噻嗪酮抗性的生化机理。分别在YN. NJ-BPF和YN-BPF品系中测定了PBO、DEM和TPP对噻嗪酮的增效作用,结果显示,三类增效剂在YN品系中对噻嗪酮都未表现出显著的增效作用。在YN-BPF和NJ-BPF品系中,PBO分别对噻嗪酮有1.77倍和1.69倍的增效作用,细胞色素P450单加氧酶活力也分别比敏感品系中升高了1.39倍和1.89倍； DEM分别对噻嗪酮有1.02倍和1.03倍的增效作用,谷胱甘肽S-转移酶活力在噻嗪酮抗、感品系间也未表现出显著差异；酯酶抑制剂TPP分别对噻嗪酮有1.50倍和1.77倍的增效作用,酯酶活力与YN品系相比分别升高了1.69倍和2.16倍。此外,YN-BPF和NJ-BPF品系中乙酰胆碱酯酶酶活力分别为YN品系的1.79和1.53倍。以上研究结果表明,酯酶及细胞色素P450单加氧酶活力的提高在一定程度上参与了噻嗪酮代谢抗性的形成,而乙酰胆碱酯酶活力升高对噻嗪酮抗性的形成可能也有一定的辅助作用。三、灰飞虱羧酸酯酶基因序列及表达量分析以云南敏感品系为材料,运用RT-PCR技术从灰飞虱转录组数据库中成功验证出31条灰飞虱羧酸酯酶基因(暂名为Ls.CarE1-31).分别在毒死蜱抗性和敏感品系中比较了这些基因的表达差异,结果发现：与YN品系相比,Ls. CarE1和Ls.CarE2在YN-CPF品系中分别具有32.6倍和7.52倍的显著过量表达。以YN-DPF品系为实验材料,分析过量表达的羧酸酯酶基因的抗性相关性,结果显示,Ls.CarE1和Ls.CarE2在抗性衰退品系中的表达量分别为敏感品系中的8.6倍和1.09倍。这些结果表明,过量表达的Ls.CarE1与毒死蜱抗性水平密切相关,而在毒死蜱抗性品系中过量表达的Ls.CarE2与抗性水平不存在一致的相关性。此外,毒死蜱抗性和敏感品系中的羧酸酯酶氨基酸序列比较发现,毒死蜱抗性个体中Ls.CarE9、Ls.CarEl6、Ls.CarE24和Ls.CarE25存在相对稳定的点突变。由此推断,不仅过量表达的Ls.CarEl参与了毒死蜱抗性的形成,部分羧酸酯酶点突变也可能是毒死蜱抗性形成的重要因子。四、灰飞虱细胞色素P450基因序列及表达分析从灰飞虱转录组数据中筛选出编码细胞色素P450的序列112条(长度从100bp到2000bp以上),去掉较短的及重复测序的序列,RT-PCR共验证出大于279bp的灰飞虱P450基因55条,其中26条具有完整的氨基酸序列编码区。进一步在灰飞虱抗、感噻嗪酮和毒死蜱的品系中分析了这些基因的表达情况。与敏感品系相比,CYP6CW1在噻嗪酮抗性品系中表现出9.75倍的过量表达。此外,3个P450基因(CYP4C,CYP4DE1和CYP6AX)在毒死蜱抗性品系中表达量与敏感品系的相比分别下降了82.01%,89.22%和92.25%。这些结果表明,过量表达的CYP6CW1可能在噻嗪酮抗性中发挥重要作用,减少的毒死蜱活化也有可能参与了毒死蜱抗性的形成。五、毒死蜱抗性相关的羧酸酯酶基因RNAi功能分析及原核表达利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了灰飞虱Ls.CarEl的全长cDNA序列。Ls.CarEl全长共1839bp,编码547个氨基酸,5’-UTR为87bp,3’-UTR为111bp。序列分析表明LsCarEl具有羧酸酯酶的基因序列特征,包括三个催化三联体氨基酸残基Ser215、Glu345、His466;氧负离子孔Gly134、Gly135、Ala217;半胱氨酸环残基Cys92、Cys110等编码序列。氨基酸序列比对表明,Ls.CarEl与已报道的褐飞虱羧酸酯酶序列(GenBank:AAG40239.1)同源性达72%。因此推断Ls.CarEl序列为灰飞虱的羧酸酯酶基因序列。接着对其RNAi分析发现,以两个不同浓度(80ng/ul和200ng/ul)的Ls.CarE1-dsRNA连续6天喂养灰飞虱抗毒死蜱品系的一龄若虫后,Ls.CarEl的表达量分别下降62.6%和68.72%。进一步以毒死蜱(800mg/L)对RNA干扰后的抗性品系灰飞虱进行毒力测定,结果显示：与对照相比,死亡率分别由33.7%上升至72.31%(80ng/ul)和31.7%上升至69.56%(200ng/ul).这些结果说明,过量表达的Ls.CarE1在毒死蜱抗性形成中发挥着重要的作用。由于基因表达量增强不一定造成蛋白水平的增加,为此通过原核表达技术成功表达了灰飞虱的Ls.CarE1,为进一步对其进行抗体制备,Western-blot检测毒死蜱抗、感品系间蛋白质量变奠定了基础。