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[目的]
中药黄连主要有效成分盐酸小檗碱(黄连素)是目前临床上广为应用的抗炎类药物,但是对于其抗肿瘤活性研究得还不充分。本研究拟探讨盐酸小檗碱体外抑制人鼻咽癌细胞株CNE-1的增殖、迁移和侵袭能力及诱导细胞凋亡的活性。在此基础上对盐酸小檗碱进行剂型改造,以比较纳米脂质体剂型与传统剂型对其活性的影响,为纳米脂质体剂型应用于中药现代化提供线索。
[方法]
酸性水溶剂煎煮法提取中药黄连中主要成分盐酸小檗碱,采用薄板层析法和高效液相色谱法进行成分鉴定,并用高效液相色谱法测定黄连中盐酸小檗碱的含量;不同浓度盐酸小檗碱处理CNE-1细胞,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测定增殖抑制率并计算出IC50;用Millicell Hanging Cell Culture Inserts法测定小檗碱对CNE-1细胞迁移和侵袭的影响;用Annexin V-FITC流式细胞术、FITC/PI双染观察CNE-1细胞凋亡情况,荧光分光光度计比色法测定Caspase-3的相对活性;主动载药法制备盐酸小檗碱纳米脂质体并用MTT法和Hoechst33258染色法鉴定盐酸小檗碱纳米脂质体的细胞毒性。
[结果]
1.自制产品得率为52.25％,熔点为255℃,薄板鉴定其迁移率rate of flow(Rf)=32.25%,对照品Rf=32.5%:HPLC鉴定结果显示样品和对照品在T=10min处无干扰,表明酸性水溶剂煎煮法能够提到纯度较高的盐酸小檗碱:
2.HPLC法测定产品中盐酸小檗碱含量,结果表明在0.2461ag～2.460μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系,在T=7.88min处无干扰。本检测方法精密度、准确度及实验仪器精密度良好,供试品溶液在24h内基本稳定,该方法简便、快速、准确,可作为评价盐酸小檗碱质量的依据;
3.盐酸小檗碱呈浓度和时间依赖性抑制CNE-1细胞的生长,其作用6、12、18、24、48h后抑制CNE-1细胞的IC50值为127.645、97.3323、40.80518、18.06713、11.72524(μg/ml);用5μg/ml、10μg/ml盐酸小檗碱处理细胞,24h后呈浓度依赖性抑制CNE-1细胞迁移,48h后呈浓度依赖性抑制CNE-1细胞的侵袭,在处理6、12、18、24、48h后用流式细胞术观察细胞凋亡情况,结果表明盐酸小檗碱作用6、12、18h后能诱导CNE-1细胞发生早期凋亡,凋亡率分别为(35.0%、58.7%)、(13.9%、31.6%)、(5.1%、30.0%),作用24h后能诱导CNE-1细胞发生晚期凋亡,凋亡率分别为(33.8%、43.8%),其作用48h后几乎不能诱导CNE-1细胞发生凋亡;5μg/ml、10μg/ml盐酸小檗碱诱导细胞凋亡6、12、24h后细胞内Caspases-3活性分别为(3.03,6.07),(2.10,3.44),(4.14,6.42);4.盐酸小檗碱纳米脂质体药物含量为0.8mg/ml,外水相最佳pH值为6.8,孵化温度为60℃,在此制备工艺条件下得到的纳米脂质体颗粒包封率达到了83%,粒径为90nm左右,脂质体起到储存和控制药物释放的作用;
5.盐酸小檗碱纳米脂质体与盐酸小檗碱纯品相比,细胞毒性较小,且对Hep-G2细胞的抑制作用更明显。
[结论]
酸性水溶剂煎煮法提取所得盐酸小檗碱可诱导CNE-1细胞凋亡,能够削弱CNE-1细胞的迁移和侵袭能力,具有增殖抑制作用;小檗碱在体内的含量会迅速减少,生物利用度不高;纳米脂质体技术可以提高其生物利用度,这种剂型改造后的体内药动学作用还需进一步研究。