研究背景前列腺癌是泌尿、男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率有明显的地区差异,西方工业化国家较高,报道仅次于肺癌,在男性是癌症发病的第二位。在我国发病率虽然较低,但是现今发病率有逐年上升的趋势。前列腺癌被临床上发现时大多已经有转移,经过雄激素祛除治疗后,大部分患者病情好转,但最终仍发展为雄性激素非依赖型前列腺癌(AIPC)。近年来前列腺癌的治疗已经取得很大的进展,诸如根治性手术切除、激素治疗、抗雄激素雄激素剥夺治疗、照射治疗、化疗或它们的不同方法的综合性治疗。基因治疗逐渐受到重视,特别是雄性激素非依赖、再发的或广泛转移的前列腺癌,基因治疗可以发挥更积极的治疗作用。前列腺癌的基因治疗有较好的发展前景,还因为它是低侵袭性并安全的一种治疗方法,它既能局部治疗、又能全身治疗,很少有合并症或副作用,故可以作为首选的治疗方案。肾素-血管紧张素系统(RAS)包括了血管紧张素原、血管紧张肽原酶、血管紧张素Ⅰ(Ang Ⅰ),血管紧张素转化酶(ACE),血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和AngⅡ受体等。一些研究揭示RAS局部表达于一些不同成分的癌细胞和组织中,其中包括了脑肿瘤,肺癌,乳腺癌,前列腺癌、皮肤癌和子宫癌等。近年的研究显示,AngⅡ1型受体(AT1R)具有促肿瘤生长和促进肿瘤血管生成的作用,运用其拮抗剂则具有抑制肿瘤生长,血管生成和癌细胞专业的作用。在大多数病理生理环境和一些研究血管生成的实验中发现,AngⅡ2型受体(AT2R)都表现着与AT1R相对立的效应。AT2R的过表达可以诱导多种细胞发生凋亡。目前,在基因载体的设计上,可以分为两大类：病毒类基因载体和非病毒类基因载体。非病毒载体的方法有电转移法法,磷酸钙共沉淀法和脂质体法。现在病毒载体主要包括系腺病毒载体,腺相关病毒载体和慢病毒载体。其中腺病毒载体具有以下特点：第一、腺病毒的宿主范围广,对人类致病性低,可用于人类或非人类蛋白的表达。第二、可以在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因。第三、能有效进行增殖,能在悬浮培养基中扩增,滴度高。第四、与人类基因组同源,大多数人类蛋白都可以达到高水平表达并且具有完全的功能。第五、不整合到染色体中,无插入导致突变性,不会干扰宿主细胞基因。第六、能够同时表达多个基因。正是由于具有以上的优点,腺病毒被广泛应用于体外基因转导,体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。运用腺病毒基因载体治疗前列腺癌有以下的优点：前列腺只是性器官并非维持生命所必需,因此在靶向基因治疗中没有必要区分正常和癌变的前列腺组织。第二,有多个前列腺特异性启动子可以使治疗性基因产品在前列腺组织特异性表达。第三,由于前列腺容易接近,基因治疗载体可以使用简单的技术操作进行前列腺内给药。另外,前列腺治疗过程和效果容易检测等特点,前列腺癌的基因治疗有较好的发展前景。本文包括两个部分,第一部分是将AT2R重组腺病毒载体Ad5-CMV-AT2R及对照载体Ad5-CMV-EGFP在293A细胞上进一步扩大培养,通过氯化铯超速离心纯化,测定病毒滴度。第二部分是人前列腺癌移植瘤动物模型的建立和移植瘤大小、细胞增殖与凋亡的检测分析。(一)AT2R重组腺病毒载体的扩增与纯化及其在人前列腺癌细胞株的梯度感染1.研究目的已经成功构建的重组AT2R腺病毒载体,在HEK293A细胞中进行大量扩增腺病毒,氯化铯梯度超速离心纯化病毒,并通过绿色荧光蛋白标记法测定病毒滴度,得到高纯度、高滴度的腺病毒。为体外动物模型体内实验,以及研究血管紧张素Ⅱ受体对肿瘤的促凋亡作用相关的基因的进一步研究奠定基础。2.研究方法2.1HEK293A细胞复苏与培养取冻存HEK293A细胞,置于37℃温水中复苏细胞。室温离心,弃去上清,以新鲜DMEM培养基重悬细胞沉淀,混匀后加入25cm2培养瓶中,加入10mlDMEM培养基(含10%FBS),37℃5%C02细胞培养箱中培养。2.2腺病毒颗粒在HEK293A细胞中的大量扩增胰酶消化处理细胞,向T75细胞培养瓶中加入10ml DMEM培养基和含5×106HEK293A细胞的悬液,置于细胞培养箱中培养48小时,细胞融合率达到90%-95%,加入适量腺病毒保存液。再培养48-72小时,细胞出现CPE。收集细胞沉淀,-20℃/37℃反复冻融3次,离心收集上清于-20℃保存。2.3氯化铯密度梯度超速离心纯化腺病毒分别配置1.4g/cm3与1.2g/cm3氯化铯溶液,并依次将4ml溶液加入超速离心管中,最后加入向离心管中加入病毒裂解液,总体积为16.5ml。放入4度超速离心机中离心80min。离心后,在1.4g/cm3氯化铯区域中可观察到乳白色病毒离心带。利用注射器在病毒带对应的位置插入离心管,抽吸纯化后的病毒转入透析袋,4℃透析过夜后分装,加入保存液后置于-70℃冰箱保存。2.4腺病毒滴度测定利用绿色荧光蛋白标记法测定腺病毒滴度。利用无血清培养对重组腺病毒进行10-2—10-6梯度稀释。胰酶消化计数,铺24孔板,每孔加入50μl待测腺病毒样品,每个样品设置3个复孔。培养48小时后,荧光显微镜下观测视野荧光细胞数。依公式titer(GFU/ml)=[(Green fluorescent cells/field) X (fields/well)]/[volume viruss(ml) X (dilution factor)],计算病毒滴度。2.5不同腺病毒滴度感染DU145细胞胰酶消化处理人前列腺癌细胞(DU145),血细胞计数板细胞计数,铺24孔板,每孔加入.500μl全培养基(含有5×105个细胞),37℃,5%C02培养24小时。分别用MOI=0、MOI=10、MOI=20、MOI=50、MOI=100不同的腺病毒浓度感染DU145细胞,每个浓度设置3个复孔。感染24小时后,在荧光显微镜下观测细胞形态。3.研究结果3.1HEK293A细胞培养将HEK293细胞置于含10%FBS的DMEM完全培养基中培养两天,在光镜下察察可见细胞单层贴壁生长,外形呈梭型或多边形,生长状态良好。3.2重组腺病毒扩增在感染腺病毒载体24小时后,在荧光显微镜下可以观察至HEK293细胞仍然保持层贴壁状态,没有明显的细胞脱落,但可以看到若干呈微弱绿色荧光的细胞。继续培养后镜下观察,荧光显微镜下Ad-CMV-AT2R-EGFP组和Ad-CMV-EGFP组中绿色荧光细胞数量逐渐增加。感染腺病毒的293细胞形态随培养时间的增加而发生改变,出现CPE现象。3.3重组腺病毒滴度测定以10-2—10-6梯度稀释重组腺病毒感染293A细胞48小时后,每孔计算三个视野,每个不同滴度计算三个复孔,计算荧光显微镜下荧光细胞数。每视野中荧光细胞数以10-50个为佳。根据公式titer(GFU/ml)=[(Green fluorescent cells/field) X (fields/well)]/[volume viruss(ml)×(dilution factor)],得Ad-CMV-AT2R-EGFP滴度为1.2×1011pfu/ml,Ad-CMV-EGFP滴度为1.4×1011pfu/ml。3.4不同MOI值腺病毒感染DU145细胞利用不同的MOI值(MOI=0、10、20、50、100)的Ad-CMV-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP感染DU145细胞,感染48小时后,在荧光显微镜下观察,两组感染的细胞产生高水平的GFP表达,绿色荧光表达的细胞数与MOI值有关。在Ad-CMV-AT2R-EGFP感染的细胞与对照组感染细胞相比,出现那典型的细胞凋亡形态(如细胞核浓缩等)。4.研究结论在本实验中,我们成功把病毒液在HEK293A细胞上进一步扩大培养,经过氯化铯超速离心纯化,得到高滴度的重组腺病毒Ad-CMV-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP。利用不同Ad-CMV-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP MOI值感染DU145细胞,AT2R组中,随着MOI的增高,镜下视野中凋亡细胞数量增加。而在EGFP组没有观察到凋亡细胞出现。这表明了AT2R重组腺病毒载体可以导致前列腺癌细胞的凋亡,并且凋亡现象随剂量增加而增加。(二)建立人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型并进行重组腺病毒瘤体注射治疗1.研究目的建立人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型并随机分组,将Ad-CMV-AT2R-EGFP及对照载体Ad-CMV-EGFP、PBS(磷酸盐缓冲液)对裸鼠皮下移植瘤进行瘤体注射,在注射治疗过程中,体外观测瘤体的生长状况并测量大小。在处死小鼠后,剥取肿瘤组织,通过免疫组织化学和TUNEL凋亡检测等方法检测AT2R过表达对前列腺癌生长的影响。2.研究方法2.1人前列腺癌细胞DU145培养及裸鼠皮下移植瘤的建立常规培养人前列腺癌细胞DU145至对数生长期,消化计数DU145人前列腺癌细胞,并重悬与无血清培养基内。共17只约5周周龄的雄性裸鼠饲养于SPF级动物房内,每只小鼠左侧腋下注射100μl含有5×106个细胞的细胞悬液。2.2裸鼠皮下移植瘤瘤体注射和瘤体生长情况监测接种DU145细胞三周后,待皮下人前列腺癌细胞移植瘤瘤径达0.5cm时,将裸鼠随机分成三组,分别为Ad-CMV-AT2R-EGFP组7只裸鼠,对照载体Ad-CMV-EGFP组、PBS组,每组各5只。三组裸鼠,每只瘤体注射0.1ml,Ad5-CMV-AT2R-EGFP,Ad5-CMV-EGFP或PBS,病毒量为1×109次方感染单位/(只·次),一次四天,共6次。每次对裸鼠进行瘤体注射治疗前,利用游标卡尺对裸鼠皮下移植瘤的移植瘤长径(a),宽径(b)进行测量并作记录,通过abb/2皮下瘤体体积公式计算瘤组织体积,并绘制肿瘤生长曲线。2.3剥取皮下移植瘤组织及处理末次瘤体注射后三天,颈椎脱臼法处死裸鼠,解剖剥取肿瘤标本,并置与液氮中冻存。分别取得各组移植瘤体组织标本,利用低温恒冷冰冻切片机对移植瘤冰冻组织进行连续切片并固定,厚度为7μm,HE染色,在光镜下观察细胞和组织结构的变化。2.4免疫组织化学法检测Ki67采用免疫组织化学技术HRP-DAB法检测不同分组的组织切片中Ki67的表达。并对Ki67免疫染色进行病理评分(每张切片5个高倍镜视野,计数阳性细胞百分比。阳性细胞数<5%计0分,5%-25%计1分,26%-50%计2分,51%-75%计3分,76%-100%计4分。着色程度：无色为0分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。两者计分相乘。)2.5荧光显微镜对移植瘤切片的观测利用低温恒冷冰冻切片机对移植瘤冰冻组织进行连续切片并固定后,将不同分组的肿瘤组织切片放置于荧光显微镜下观测。2.6原位末端标记法(TUNEL)检测移植瘤细胞凋亡DNA原位末端标记法(TUNEL)原位细胞凋亡检测,在10×40倍镜下采集每例TUNEL阳性组织切片的5个不同的视野,计数每个视野中的阳性细胞数以及总细胞数,进行定量分析,凋亡指数(apoptosis index, AI)=阳性细胞数/总细胞数。2.7移植瘤组织mRNA表达检测液氮研磨不同分组的移植瘤组织,Trizol法提取组织RNA,利用荧光定量PCR检测(GADD45A,AT2R, VEGF,Trail-R2)mRNA表达。2.8统计学处理采用SPSS13.0统计软件,运用重复测量分析方法分别比较Ad-CMV-AT2R-EGFP组及Ad-CMV-EGFP组、PBS组移植瘤体积是否存在统计学差异；免疫组织化学Ki67免疫染色和TUNEL凋亡检测后,对各组切片进行病理评分,并把各组评分进行统计学分析。对各分组肿瘤组织中mRNA(GADD45A,AT2R,VEGF,Trail-R2)表达水平进行统计学分析。P<0.05为差异有显著性。3.研究结果3.1裸鼠皮下移植瘤建立与瘤体生长检测DU145细胞经台盼蓝染色后确定活细胞技术在95%左右,注射前列腺癌细胞三周以后,裸鼠皮下形成肉眼可见的肿瘤。对已随机分组小鼠注射Ad-CMV-AT2R-EGFP、Ad-CMV-EGFP组、PBS,并在每次注射时测量记录瘤体大小。动物处死时,测量得Ad-CMV-AT2R-EGFP组(0.2531±0.053)cm2,Ad-CMV-EGFP组为(0.4034±0.05)cm2, PBS组为(0.391±0.103)cm2。根据各组肿瘤体积数据统计学分析得出,AT2R组肿瘤体积明显小于EGFP组和PBS组,P<0.05,具有统计学意义。3.2荧光显微镜对移植瘤切片的观测利用荧光显微镜分别观察Ad-CMV-AT2R-EGFP组、Ad-CMV-EGFP组、PBS组冰冻切片。在镜下可以观察到AT2R组与EGFP对照组组织切片中有绿色荧光均匀分布,EGFP对照组较AT2R组绿色荧光蛋白表达强。而PBS组中不能观察到绿色荧光。3.3免疫组织化学法检测Ki67免疫组化结果显示,各组移植瘤结果为：AT2R组为(4.8±1.09),EGFP对照组为(7.8±1.32),PBS组为(7.4±1.43)。通过各组评分进行统计学分析,表明AT2R组Ki67表达水平明显低于EGFP对照组和PBS组,P<0.05,具有统计学意义。3.4原位末端标记法(TUNel)检测移植瘤细胞凋亡凋亡指数(apoptosis index, AI)=阳性细胞数/总细胞数。AT2R组为8.47%,GFP组为1.48%,PBS组为1.92%。各组间AI进行统计学分析,得出AT2R组分别与GFP组、PBS组具有显著统计学差异,P<0.05。而GFP组与PBS组间无差异。3.5移植瘤组织mRNA表达检测利用荧光定量PCR检测(GADD45A,AT2R,VEGF,Trail-R2)mRNA表达.在注射AT2R组中AT2R高表达,而在GFP组与PBS组中几乎不能检测到AT2R的表达,AT2R组分别于GFP组、PBS组间具有统计学意义,P<0.05。AT2R组中GADD45a表达对比GFP组和PBS组,分别有1.4倍和1.3倍的增加,具有统计学意义,P<0.05。而Trail-R2与VEGF分别在三组中表达无显著统计学差异。4.研究结论本次试验中,我们通过在雄性裸鼠皮下注射人前列腺癌细胞,成功地建立裸鼠皮下移植瘤动物模型。通过对瘤体注射过表达AT2R重组腺病毒载体,研究其对前列腺癌细胞的生长,增殖及细胞凋亡的影响。量度移植瘤体积,AT2R组瘤体生长速度明显低于GFP组和PBS组Ki67免疫组织化学检测,TUNEL凋亡检测结果都说明了AT2R过表达抑制肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡。