肝素是被广泛应用于临床中的抗凝血和抗血栓药物。目前全世界每年生产和使用约100吨的医药级肝素,主要为动物源肝素。2008年的肝素污染事件,使得非动物源肝素的生产受到关注。大肠杆菌荚膜多糖heparosan具有与肝素类似的多糖骨架可作为肝素、硫酸乙酰肝素的生物合成前体,其硫酸化修饰以及解聚并制备肝素或低分子肝素成为研究热点。Heparosan酶法硫酸化修饰时需芳香磺基转移酶Ⅳ和PAPS再生体系为该反应提供硫酸基团;而heparosan解聚的过程中会在其非还原端产生一个△ 4,5不饱和葡萄糖醛酸键,因而需要△4,5不饱和葡萄糖醛酶来修复该不饱和键。本文进行了大肠杆菌芳香磺基转移酶Ⅳ表达和纯化制备,同时从肝素黄杆菌中克隆到了 △4,5和△4,5△20不饱和葡萄糖醛酸酶的基因,并在大肠杆菌实现了表达和纯化制备,考察了该酶对肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对heparosan和肝素类底物解聚产物的修复作用。首先IPTG诱导携带AST-Ⅳ基因的工程菌成功表达了芳香磺基转移酶Ⅳ,分子量为34.08 kDa。通过低温培养,获得了部分可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后,酶比活力为40.95 U/mg,纯化了3.38倍。从肝素黄杆菌克隆得到了 △4,5和△4,5△20不饱和葡萄糖醛酸酶基因,经测序和BLAST比对发现△4,5基因片段与NCBI报道的Pedobacter heparinus DSM 2366 菌株的 glycosylhydrolase family 88 同源性为 100%。DNAMAN分析发现△ 4,5和△ 4,5△20基因片段分别编码402个氨基酸和382个氨基酸,蛋白大小分别为46 kDa和44 kDa。构建了重组表达质粒pMAL-c2X-△4,5和pMAL-c2X-△4,5△20,并转化至E.coli TB1,获得重组菌E.coli TB1/pMAL-c2X-△4,5和E.coli TB1/pMAL-c2X-A4,5△20。经IPTG 诱导,实现了融合蛋白 MBP-△4,5 和MBP-△4,5△20在大肠杆菌的成功表达,Amylose Resin亲和层析得到了MBP-△4,5△20蛋白,利用UN-Scan-itgel6.1软件分析融合蛋白分子量,大小约为76kDa,纯化后的酶比活力为325.47U/mg,纯化了 8.09倍。利用本实验自行制备的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对3种不同的底物heparosan、硫酸乙酰肝素和肝素钠进行解聚,考察了本研究制备的△4,5△20不饱和葡萄糖醛酸酶对这几种不同解聚产物的修复作用。