巴斯德毕赤酵母是世界上应用最为广泛的外源蛋白真核表达系统之一。作为甲基营养型酵母,毕赤酵母也是研究甲醇利用途径和过氧化酶体合成途径的一种模式酵母。毕赤酵母的全基因组测序工作于2009年完成,然而,到目前为止,绝大部分基因的功能仍未被鉴定,超过30%的基因被注释为假定蛋白。为加快毕赤酵母未知功能基因的鉴定,本研究在毕赤酵母中开发了一种基于piggyBac（PB）转座子的高效转座突变系统,用于正向遗传筛选;开发了一套基于TcBuster（TcB）和Sleeping beauty（SB）转座子的TcB/SB联合转座子系统,用于毕赤酵母必需基因的鉴定及功能基因的筛选。PB转座子拥有很高的转座效率和精确的位点剪切能力,是真核生物中应用最为广泛的一种转座子。PB转座子的原始转座酶PBase可使转座元件的转座频率达到0.03,经突变改造的转座酶hyPBase可实现频率为0.43的转座效率,几乎每两个细胞就有一个细胞会发生转座突变。本研究中,使用基于PB的转座突变系统筛选到3个碳源代谢阻遏基因,分别是PAS_chrl-l₀300、PAS_chr4₀334和PAS_chr4₀769。前两者参与葡萄糖阻遏甲醇的功能已经有文献报道,后者是首次在毕赤酵母中得到鉴定的基因。全基因组必需基因的鉴定有利于认识许多生命过程的分子基础,诸如代谢研究和合成生物学等领域研究进展受益于近年来越来越多生物组织的必需基因得到鉴定。传统鉴定必需基因的方法是通过基因敲除以判断其致死性,但该方法耗时耗力。近年来,转座子突变技术和高通量测序技术联合,形成了转座子插入测序技术,大大加快了必需基因的鉴定。但到目前为止,绝大部分转座子插入测序的应用都是局限在细菌中,其中一个重要原因是细菌拥有诸如mariner和Tn5这种低偏好性的转座子系统。为在毕赤酵母中建立转座子插入技术,本研究尝试检测五种随机性强、插入核心靶位点为TA碱基的转座子,最终检测到TcB和SB在毕赤酵母中的转座事件,转座效率分别为-1.2×10-2和-2.1×10-3。为减少实验工作量,我们开发了一种液体富集方法,可以提高转座突变株的密度。研究发现,TcB和SB在毕赤酵母中插入偏好性存在一定的互补性,将两种转座子的插入数据联合使用有利于基因必需性的分析。合并TcB和SB的插入突变库后,在葡萄糖条件下鉴定得到202858个独立插入位点,平均每1 kb基因组序列拥有22个插入。利用这些亚饱和插入数据,本研究开发了一种机器学习逻辑斯蒂回归分类模型,将毕赤酵母的5040个注释基因分类为必需基因、非必需基因和模糊类。推定的必需基因共有1086个基因,其中有491个基因与酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的必需基因同源,这类必需基因可能参与了基因转录、蛋白翻译和初级代谢等基础过程。有些基因是毕赤酵母专属的必须基因,这类基因可能在甲基营养型酵母中扮演重要角色。进一步地,结合之前的实验数据和本实验室的基因敲除数据去预测分类系统的精确性。为分析基于条件必需基因的筛选方法在毕赤酵母中的可行性,本研究还应用此技术鉴定了毕赤酵母的甲醇条件必需基因,通过比较葡萄糖条件必需基因和甲醇条件必需基因,初步筛选出126个可能参与甲醇利用途径的功能基因。这些基因包括了一些已知的甲醇代谢相关的基因和一些未知的假定基因,并通过点板实验和甲醇氧化酶显色实验验证了部分未知基因。作为非常规酵母的一员,毕赤酵母的研究团队远少于酿酒酵母和粟酒裂殖酵母这两种模式酵母的研究团队。研究经费和实验劳动力的不足阻遏了全基因组敲除实验在非常规酵母中的应用。本研究在毕赤酵母中开发的转座子插入测序技术,为毕赤酵母提供了一种低劳动成本的基因必需性鉴定方法。这种方法有希望进一步拓展到其他非常规酵母中。