背景:世界上肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高,男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位,女性发病率占第二位,死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确。本课题组在比较小鼠脾脏树突状细胞是发现多个在CD8alpha+DC中高表达基因中包含有PCNP,多年来本课题组围绕着PCNP做了多方探讨,一直致力于对PCNP的深入研究,主要在炎症和肿瘤方面。之前研究发现PCNP与TIPE2、JNK1等蛋白分子在白血病、类风湿关节炎及胰腺癌等疾病发生中扮演者某些角色,对细胞的生长增值有明显的调节作用;PCNP的表达改变在对小鼠DC细胞的抗原递呈能力有一定的影响。PCNP(PEST-Containing Nuclear Protein)是种含有PEST基序的核蛋白质,另有研究报道它与泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING Figer Protein)相互作用,可能是其反应底物。NIRF 包含有类泛素化区域(a ubiquitin-like domain),YDG/SRA 区域(a YDG/SRA domain),PHD区域(a PHD domain)和指环状区域(a RING domain)四个主要功能结构域,研究发现NIRF在正常细胞增殖期间呈现高表达,而在G0/G1期间呈现低表达,在多种肿瘤细胞中也持续升高,这表明NIRF参与细胞的周期调控,参与肿瘤发生的某些方面。核蛋白PCNP含有的PEST基序(其中有丰富的脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)),而含有PEST基序的蛋白质的通常是参与蛋白质水解途径的调控,并且大多数蛋白质是通过泛素化介导途径而降解得。NIRF本身具有泛素连接酶的特征,且其自身具有自动泛素酶的活性,泛素依赖性蛋白的降解可以调节依靠泛素化途径的蛋白质在多种细胞周期的参与过程,目前研究证实,这些过程包括细胞的周期进程、蛋白质的运输、DNA的损伤和变异。NIRF泛素连接酶与蛋白质的特异性底物PCNP结合,进而影响泛素化反应的功能与效率。例如核蛋白PCNP在293T细胞和COS-7细胞中被泛素化率很高,在体内和体外NIRF都能够把PCNP泛素化。这说明NIRF与PCNP信号通路可能通过对细胞周期的调控而对细胞增殖发挥一定的调节作用。同时研究表明,在很多肿瘤细胞基因中NIRF在9p23-24.1段基因出现的频繁明显高于正常细胞,推测PCNP和NIRF可能与肿瘤发生有一定的关系。关于PCNP的研究除了本研究小组外很少有报道文献参考。为了能够更好的设计研究技术路线,我们从PCNP特征的结构域PEST基序着手查阅了大量关于PEST结构的文献。文献整理发现含有PEST基序的蛋白质大多参与了蛋白质翻译后的调控,其主要通过自身的泛素化-蛋白酶体降解路径和基序内丝氨酸及酪氨酸的磷酸化修饰来精密调控着蛋白质的表达量,维持蛋白质的功能。为了研究PCNP与肺腺癌的发生关系及分子机制,我们首先又一次进行了大数据挖掘,发现核蛋白PCNP的在子宫内膜癌、子宫颈癌、直肠癌、肺癌及胃癌等组织的恶性肿瘤细胞内表达量较高;在正常组织内,除肝脏、海马及心肌这三处组织表达量较少外,其他组织内表达均较高;在已经知道的细胞系内都有不同程度的表达。由此可见核蛋白PCNP参与了多种肿瘤的发生发展,在大多数组织内有稳定表达。本人在临床工作中从事着肺癌的穿刺诊断与治疗工作多年,通过收集到肺腺癌组织蜡块标本进行免疫组织比对分析发现肺腺癌组织内核蛋白PCNP的表达了明显高于癌旁组织,提示着PCNP参与了肺腺癌的发生的过程,但机制上不明确。如果能够找到核蛋白PCNP与肺腺癌的发生关系,确定其中的分子机制,有利于肺腺癌的诊断、治疗及预后评估。本研究通过分析核蛋白PCNP在肺腺癌中的表达情况,通过上海芯超芯片公司基因组织芯片检测,研究核蛋白PCNP在人肺腺癌组织的表达量,并分析核蛋白PCNP的表达对肺腺癌临床症状、分期及预后生存时间的相关性。在细胞水平上,我们选择人肺腺癌细胞系A549作为研究对象,通过改变核蛋白PCNP在A549细胞中的表达变化,探讨其对细胞增殖、迁移、凋亡及成瘤性性的影响,为肺腺癌的预防、临床诊断、治疗及预后监测提供新的靶点与理论依据。目的:1.通过组织芯片及临床资料相关性分析确认核蛋白PCNP在人肺腺癌中的表达及临床相关性。2.通过过表达及敲低PCNP在A549细胞中的表达,探讨PCNP表达变化对A549细胞增殖、迁移、凋亡及成瘤性性的影响。方法:通过收集临床78例肺腺癌病例,病理组织蜡块及预后临床资料,进行组织芯片分析,确认核蛋白PCNP在肺腺癌组织及细胞内的表达情况;利用大数据多因素相关性分析,确认核蛋白PCNP与肺腺癌临床症状、病理分级、临床分期及预后生存时间的相关性。构建人类PCNP的真核表达载体GV-230-PCNP,瞬时转染A549细胞,用G418新霉素筛选,带有G418抗性的细胞为PCNP过表达A549细胞稳定株;用GV-240-RNAi-PCNP质粒转染A549细胞,用嘌呤霉素筛选出敲低PCNP的A549稳定株细胞,这两种稳定株细胞均有各自的空载体对着细胞稳定株。之后,首先通过Western Blot验证各种稳定株细胞PCNP蛋白表达水平,确认PCNP过表达和敲低稳定株细胞的构建成功;通MTS和EDU实验检测各稳定株细胞的增殖能力;通过划痕实验及Transwell实验检测各稳定株细胞的迁移能力;通过Invision实验检测各稳定株细胞的侵袭能力;通过Western Blot检测Bax表达量检测细胞的凋亡。通过平板克隆形成实验检测稳定株细胞的克隆形成能力。结果:1.临床病例资料及组织芯片结果PCNP在肺腺癌细胞内的表达明显高于癌旁组织(尸<0.01);PCNP在肺腺癌细胞核内的表达量明显高于细胞浆内的表达(P<0.01)。2.核蛋白PCNP的表达与临床相关性分析未能得到确切相关关系(P<0.05);患者生存时间主要与临床分期相关(P<0.05)3.过表达和敲低PCNP在A549细胞中的表达之后(1)MTS和EDU结果发现PCNP过表达细胞增殖快,敲低PCNP后细胞增殖慢(P<0.05)。(2)划痕实验及Transwell实验结果显示PCNP过表达A549细胞迁移快(P<0.01),敲低PCNP后A549细胞迁移慢(P<0.01)。(3)Invision实验结果过表达PCNP后A549细胞侵袭能力增强(P<0.01),敲低PCNP后A549细胞侵袭能力减弱(P<0.01)。(4)通过Western Blot检测Bax表达量结果显示PCNP过表达A549细胞凋亡减少,敲低PCNP后A549细胞凋亡增加(P<0.01)。(5)平板克隆形成实验结果过表达PCNP后A549细胞克隆形成能力增强(P<0.01),敲低PCNP后A549细胞克隆形成能力减弱(P<0.01)。结论:(1)核蛋白PCNP在肺腺癌组织细胞核及胞浆内表达均高于癌旁组织。(2)人肺腺癌患者生存期与肿瘤大小及临床TNM分期负相关,与癌细胞PCNP表达量无相关。(2)核蛋白PCNP促进A549细胞的增殖和迁移,侵袭及成瘤性,降低凋亡。