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目的:观察糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Muller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的作用及bFGF对该细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨AGEs对于糖尿病视网膜病变(DR)发生发展的可能作用机制。
方法:取健康新西兰大白兔,处死后在无菌条件下摘取眼球,采用组织块贴壁法培养兔视网膜Muller细胞备用；37℃条件下用牛血清白蛋白(BSA)及无水葡萄糖体外制备AGEs-BSA及其对照物备用。AGEs影响bFGF的实验分为空白对照组、AGEs-BSA实验组及AGEs-BSA对照组,根据AGEs-BSA及其对照物占DMEM培养液的体积分数将后两组各分为4％、8％、16％、32％、64％这5组,每组分别干预1d、3d、6d、9d后,采用免疫细胞化学(ICC)方法检测各组兔视网膜Muller细胞bFGF的表达情况；bFGF影响VEGF实验将重组bFGF以DMEM培养液配制成不同浓度,实验分为空白对照组及bFGF实验组,实验组分为5个浓度组,分别为(0.1、1.0、10.0、50.0、100.0)ng/mL。每组分别干预1d、3d、6d、9d后,采用ICC方法检测各组兔视网膜Muller细胞VEGF的表达情况。ICC图像用IPP 5.0.1分析软件进行半定量分析,对比各组细胞表达的平均光密度(MOD)值,并作统计学处理。
结果:培养的兔视网膜Muller细胞呈单层密集生长,胞体呈长梭形,胞浆丰富,胞核位于胞体中央、呈椭圆形、有2个或2个以上核仁,具有培养Muller细胞的典型形态特征。ICC半定量检测结果显示：与空白对照组相比,AGEs-BSA实验组除4％体积分数组在1d、3d、6d,8％体积分数组在1d、3d及16％体积分数组在1d无明显变化外,其余各组bFGF表达均明显增加,差异有显著性(P<0.01);与AGEs-BSA对照组相比,AGEs-BSA实验组除4％体积分数组和8％体积分数组在1d、3d、6d、9d,以及64％体积分数组在1d无明显变化外,其余各组bFGF表达均明显增加,差异有显著性(P<0.05)。同时,AGEs-BSA增强Muller细胞bFGF的表达具有一定时间浓度依赖性,即bFGF的表达随AGEs-BSA干预时间延长及干预浓度增加而增加,但64％分数组在1d时与32％体积分数组相比差异无显著性(P>0.05),而在3d、6d和9d时,bFGF表达均有所下降。
结果同时显示：在同一时间点,不同浓度bFGF实验组的Muller细胞,其VEGF表达差异具有显著性(P<0.01);在一定的浓度范围内(0.1ng/mL到10.0ng/mL),随着bFGF干预浓度的增加,VEGF表达呈逐渐增加的趋势(P<0.05),但当达到较高浓度(50.0ng/mL)后,VEGF表达不再增加,此时与10.0ng/mL组比较,差异无显著性(P>0.05)。在不同时间点,对于空白对照组,视网膜Muller细胞VEGF的表达差异无显著性(P>0.05)：而在bFGF实验组中,当bFGF干预3d时,视网膜Müller细胞VEGF的表达较干预1d时显著增加,差异具有显著性(P<0.01),干预6d、9d时与干预3d相比,视网膜Müller细胞VEGF的表达差异无显著性(P>0.05)。
结论: AGEs可以上调视网膜Müller细胞表达bFGF,而bFGF可以上调视网膜Müller细胞表达VEGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达以及通过分泌的bFGF间接促进VEGF的表达而在DR形成过程中起重要作用。