鲤春病毒血症（Spring virernia of carp,SVC）是由鲤春病毒血症病毒（Spring virernia carp virus,SVCV）引起的,能够造成多种鲤科鱼类大量死亡的传染性疾病。它是世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）必报的重要疫病,也是我国2008年颁布的动物疫病病种名录中的一类动物疫病。该病一般发生于春季,具有流行范围广、发病率高、死亡率高的特点,目前尚无有效的防治方法。对于病毒病的防控,疫苗一直是最为理想的选择。其中口服疫苗是当前最受欢迎的鱼用疫苗,可用于规模化免疫,解决了免疫操作工作量大、鱼苗免疫难等问题。因此,本研究拟利用酵母表面展示技术,将SVCV糖蛋白（Glycoprotein,G）展示于酿酒酵母细胞表面,口服免疫鲤鱼（10±2 g）。通过测定血清中和抗体效价、免疫相关基因表达量变化以及相对免疫保护率等指标,对所构建的酵母活载体口服疫苗的免疫保护效力进行评价。具体研究内容及结果如下:1、以SVCV shlj1分离株基因组RNA为模板,通过RT-PCR技术,体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框（1530 bp）片段,将其克隆至酿酒酵母（EBY100）表面展示载体pYD1,构建重组质粒pYD1-G。利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母感受态细胞,经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定,挑选出阳性转化子,对其进行2%半乳糖诱导。利用间接免疫荧光抗体检测技术和流式细胞仪检测SVCV G蛋白的酵母表面展示情况。间接免疫荧光抗体检测结果显示,诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光,且随着诱导时间的增加,红色荧光的酵母细胞比例不断增加。利用Image J软件对免疫荧光镜检视野（n=10）进行分析可知,诱导0、24 h、48 h、72 h阳性酵母细胞所占比例平均值分别为8.38%、24.20%、55.30%和72.41%,且各组之间阳性酵母比例差异显著（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示,诱导0、24 h、48 h、72 h时,酵母细胞平均荧光强度分别为2112、7086、10236、10554,酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比。但诱导48 h酵母细胞表面荧光强度与诱导72 h相比差异不显著。综合间接免疫荧光抗体检测结果和流式细胞仪检测结果,本研究选取48 h为SVCV糖蛋白酵母表面展示的最佳诱导时间。2、大量制备表达SVCV G蛋白的重组酵母菌,利用无菌PBS调节菌液终浓度为1×10⁹CPU/mL,用以免疫幼鲤（10±2 g）,每次口服灌喂100μL。分别设置单次免疫EBY100-pYD1-G组（连续免疫7 d）、多次免疫EBY100-pYD1-G组（免疫2次,间隔7 d,每次连续免疫7 d）以及EBY100-pYD1组（单次免疫组和多次免疫组）。于免疫后的第7 d、14 d、21 d、28 d采集鲤鱼的头肾和脾脏,利用反转录实时荧光定量PCR（Reverse Transcription Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR）检测组织器官中TNF-α、CD4、IgT相对表达水平;于免疫后第42d,利用上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini,EPC）检测各组鲤鱼血清SVCV中和抗体效价;于免疫后的第30d,用10⁶.28.28 TCID₅₀/mL的SVCV病毒培养液,采用浓度100TCID₅₀/mL,对免疫后的幼鲤进行腹腔注射攻毒,每尾接种50μL,连续观察21 d记录鲤鱼的死亡情况,利用公式RPS=[1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100%,计算口服疫苗的相对保护效率,以评价重组酵母菌的免疫保护效力。免疫相关基因表达量测定结果显示,口服重组酵母菌EBY100-pYD1-G实验组中CD4、TNF-α和IgT基因表达水平均出现了不同程度的上调,各基因表达水平均呈现先高后低的趋势。CD4基因表达量于免疫后的21 d达到峰值,与对照组相比差异显著（P<0.05）。免疫后第28 d,在头肾和脾脏中,多次免疫EBY100-pYD1-G组CD4表达量分别为单次免疫EBY100-pYD1-G组的3.26倍和3.19倍,差异显著（P<0.05）。TNF-α基因表达量于免疫后的21 d达到峰值,与对照组相比差异显著（P<0.05）,且头肾中多次免疫EBY100-pYD1-G组TNF-α基因表达量显著升高,是单次免疫EBY100-pYD1-G组的3.29倍,差异显著（P<0.05）;在脾脏中多次免疫EBY100-pYD1-G组和单次免疫EBY100-pYD1-G组差异不显著。Ig-T基因在14 d时达到最大值,与对照组相比差异显著（P<0.05）,且在头肾和脾脏中,多次免疫EBY100-pYD1-G组Ig-T基因表达量出现大幅度的提高,分别是单次免疫EBY100-pYD1-G组的3.18倍和3.07倍,差异显著（P<0.05）。血清中和抗体效价结果显示单次免疫EBY100-pYD1-G组和多次免疫EBY100-pYD1-G组中和抗体平均效价分别为31.9和40.6,而EBY100-pYD1免疫组鲤鱼血清中无任何SVCV中和抗体,各组之间均差异显著（P<0.05）。免疫保护率分析结果显示,单次免疫EBY100-pYD1-G和多次免疫EBY100-pYD1-G的相对保护率分别为37.14%和43.24%,二者之间差异显著（P<0.05）。该结果表明免疫EBY100-pYD1-G重组酵母菌能够显著降低鲤鱼的死亡率,且多次免疫组免疫效果显著优于单次免疫组。综上所述,本研究制备的SVCV酵母活载体口服疫苗能够刺激鲤鱼产生特异性和非特异性免疫应答,对抵抗SVCV侵染有显著的保护作用,有望成为预防SVCV的新型口服疫苗。