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蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vacciniumspp.)的多年生灌木果树。因其果实富含花青素、黄酮等活性物质而被称为“五大健康水果”之一。近年来南方各省蓝莓产业发展迅猛,但相关栽培生理的研究则严重落后。目前生产实践中已经明确蓝莓是一种忌氯植物,但相关机理却未见报道。氯(Chlorine,Cl)为植物16种必需营养元素之一,但其过量则引起植物叶片产生褐色焦状斑点,严重时导致落叶甚至植物死亡。但有关植物对氯毒胁迫内在的伤害机理仍缺乏相关的研究。 本论文以对氯离子较敏感的‘布里吉塔’及较耐受品种‘夏普蓝’两品种蓝莓苗为材料,主要研究了氯胁迫下对植株光合生理及氮代谢通路相关基因表达的影响;并通过Illumina Hiseq测序平台以蓝莓在氯离子胁迫条件下的叶片为样品进行转录组测序,获得大量转录本序列;接着,分别构建2个表达谱文库(即正常对照与150 mM Cl-2d文库),筛选两两差异表达基因,建立数字基因表达谱,以期从基因表达角度揭示氯离子胁迫对植物的损伤机理,为农业生产实践中提高肥水管理提供理论基础。研究主要结果如下: 1、氯胁迫处理4d时150 mmol/L氯胁迫水平下,两品种叶片叶缘均出现焦黄,随着处理的加重及时间的延长,症状愈加明显;而叶绿素含量及质膜透性等均在75 mmol/L氯离子处理2d就出现显著差异;氯胁迫下,蓝莓叶片光合速率显著下降、Fv/Fm等荧光参数异常、PSⅡ系统中PsbP、 PsbE、PsbR几个蛋白基因的表达显著下降,反映PSⅡ已经受到损伤;这可能是由于Chl Cu/Zn-SOD、Cyt Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Cyt Mn-SOD以及POD、CAT等抗氧化酶的表达量下降导致活性氧自由基的积聚导致的。两品种相较而言,夏普蓝明显较布里吉塔更晚出现氯毒症状,PSⅡ中心蛋白基因及抗氧化蛋白基因的表达量降幅亦普遍更小,其原因可能是由于夏普蓝相对更耐氯胁迫。 2、利用qRT-PCR分析氯离子胁迫对蓝莓叶中氮代谢相关基因的表达变化,结果发现与对照相比,铵转运蛋白AMT2在氯胁迫2d时表达显著增加,相反地AMT1、AMT3基因的表达量下降,说明氯胁迫对AMT基因的表达有不同的影响,且各种AMT基因的表达受环境影响的效应各不相同;两品种蓝莓叶中硝酸转运蛋白(NRT1.5和NRT2)以及硝酸还原酶(NR)的表达水平普遍受氯胁迫的诱导而呈上调趋势,尤其在75 mM时增幅最高,这可能是蓝莓应对氯胁迫的一种适应性反应。 3、通过Illumina Hiseq测序平台完成蓝莓叶片转录组测序获得RNA-seq高质量测序数据,对所有clean data进行从头组装,通过组装得到103,560个转录本,平均长度为1027.95 bp,其中最长转录本达13,843 bp,最短转录本长度为201 bp。大部分(57.58%)长度大于400 bp。我们将得到的All-Unigene与已知的公共数据库蛋白质数据库NR,COG数据库和KEGG数据库等进行比对。结果发现在设定的E值区间内有6,151(47.02%)个和3,489(26.67%)个All-Unigene能够比对到GO数据库和KEGG数据库。但仍有12.9%的All-Unigene在NR库中不能得到注释。其原因可能是由于蓝莓自身没有全基因组数据库,已知的EST数量有有限;另一方面可能是测序的一些短片段重复性较高,不能够得到有效的比对结果。 4、对表达谱文库进行差异表达基因分析,利用KEGG数据库,将基因按照参与的pathway通路或行使的功能分类,以样本0mM Cl-处理0d为对照,针对两两分组的差异表达基因将差异基因显示在KEGG pathway通路图上,展示差异基因KEGG通路的有306个Pathway。其中能够注释到代谢通路(Metabolicpathways)、次生代谢产物生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)以及光合作用(Photosynthesis)的unigenes分别有1177、700和45个。利用GO数据库,将基因进行分类与GO注释统计得知,在150mM氯胁迫2d的蓝莓叶片组织中有7,200个基因表达显著上调,2,825个基因表达显著下调,共计10,025个基因差异表达。其中得到DNA重组相关基因123个,错配修复差异表达基因123个及DNA复制相关基因235个。