本论文研究工作得到“十二五”国家科技支撑计划、国家教育部“新世纪优秀人才支持计划”和江苏省高校优秀学科建设工程项目资助。本论文主要分为四章。一、文献研究本部分在对相关文献进行整理的基础上,综述了银杏种子的应用历史沿革、资源化学、药理学、毒理学的研究现状。二、银杏种子资源化学成分研究(一)银杏外种皮资源化学成分研究基于对银杏种子综合利用和开发,采用硅胶、聚酰胺、Sephadex LH-20凝胶柱层析等色谱技术对银杏种子的外种皮部分所含化学成分进行分离、纯化,根据其理化性质及波谱数据鉴定其结构。对银杏外种皮化学成分进行了系统分离,共分离得到了24个化合物,经理化常数和波谱学数据鉴定,与文献对照证明其分别为(7S,8R,11S)-二十九烷三醇(GBS-1)、(10R,12R,15S)-二十九烷三醇(GBS-2)、二十八烷酸(GBS-3)、二十四烷酸(GBS-4)、二十烷酸(GBS-5)、二十九烷-10-醇(GBS-6)、β-谷甾醇(GBS-7)、6-(十五烷基)-水杨酸(GBS-8)、6-(8-十五碳烯)-水杨酸(GBS-9)、6-(10-十七碳烯)-水杨酸(GBS-10)、二十烷酸-1-甘油酯(GBS-11)、芹菜素(GBS-12)、槲皮素(GBS-13)、山奈酚(GBS-14)、金松双黄酮(GBS-15)、银杏黄素(GBS-16)、异银杏黄素(GBS-17)、银杏内酯A(GBS-18)、银杏内酯B(GBS-19)、银杏内酯C(GBS-20)、白果内酯(GBS-21)、胡萝卜苷(GBS-22)、D-葡萄糖(GBS-23)、蔗糖(GBS-24)。其中,GBS-1、GBS-2为新化合物,GBS-11为首次从该种植物中分得。(二)银杏中种皮资源化学成分研究采用硅胶及凝胶柱层析等色谱技术对银杏种子的中种皮部分所含化学成分进行分离、纯化,根据其理化性质及波谱数据鉴定其结构。对银杏中种皮化学成分进行了系统分离,共分离得到了18个化合物,经理化常数和波谱学数据鉴定,与文献对照证明其分别为十八烷酸(GBM-1)、棕榈酸(GBM-2)、二十九烷-10-醇(GBM-3)、β-谷甾醇(GBM-4)、正三十二烷醇(GBM-5)、正二十二烷醇(GBM-6)、6-(十五烷基)-水杨酸(GBM-7)、6-(8-十五碳烯)-水杨酸(GBM-8)、正二十二烷酸-1-甘油酯(GBM-9)、正二十烷酸-1-甘油酯(GBM-10)、正十六烷酸-1-甘油酯(GBM-11)、1,3-十六烷酸-甘油酯(GBM-12)、1,3-二亚油酸-甘油酯(GBM-13)、三硬脂酸甘油酯(GBM-14)、三棕榈酸甘油酯(GBM-15)、银杏内酯B (GBM-16)、银杏内酯C (GBM-17)、胡萝卜苷(GBM-18)。化合物GBM-5、GBM-6、GBM-9～GBM-15为首次从该植物中分离得到,所有化合物均为首次从银杏中种皮中分离得到。(三)银杏种仁资源化学成分研究采用硅胶及凝胶柱层析等色谱技术对银杏种仁部分所含化学成分进行分离、纯化,根据其理化性质及波谱数据鉴定其结构。对银杏中种皮化学成分进行了系统分离,共分离得到了20个化合物,经理化常数和波谱学数据鉴定,与文献对照证明其分别为二十六烷酸(GBK-1)、棕榈酸(GBK-2)、二十九烷-10-醇(GBK-3)、β-谷甾醇(GBK-4)、正十六烷酸-1-甘油酯(GBK-5)、熊果酸(GBK-6)、金松双黄酮(GBK-7)、银杏黄素(GBK-8)、异银杏黄素(GBK-9)、胡萝卜苷(GBK-10)、银杏内酯A(GBK-11)、银杏内酯B(GBK-12)、银杏内酯C(GBK-13)、尿嘧啶(GBK-14)、松柏苷(GBK-15)、daphnenoside(GBK-16)、甘草苷(GBK-17)、腺苷(GBK-18)、葡萄糖(GBK-19)和蔗糖(GBK-20),化合物GBK-6、GBK-15～GBK-18为首次从该植物中分离得到,化合物GBK-1～GBK-5、GBK-7～GBK-10、GBK-14为首次从银杏种仁中分离得到。三、银杏种子资源化学评价研究(一)核苷类成分资源化学评价首次建立了一种快速、简单、灵敏的HILIC-UPLC-TQ/MS2分析方法用于核苷类成分的分析,本研究以银杏种子为例对所建立的新方法进行应用。1.不同部位银杏种子样品中核苷及碱基类成分的分析应用所建立的分析方法测定了银杏种子的五个不同部位(外种皮、中种皮、内种皮、胚乳和胚芽),样品主要收集于中国银杏生产的三大主产区分别为江苏(泰兴)、山东(郯城)和广西(灵川),因此共15批银杏种子不同部位样品,测定的结果显示20种核苷及碱基类成分的总量变化范围为64.1～3249.4μg/g,分析结果表明银杏种子五个部位中核苷类成分总含量由高到低的顺序为：胚芽>胚乳>外种皮>内种皮>中种皮。同时研究结果还表明在银杏种子不同部位中核糖核苷类含量明显高于脱氧核糖核苷类。在核苷类成分含量较高的胚乳和胚芽部位鸟苷、尿苷及其相应的碱基明显高于其他的核苷及碱基。2.不同年龄银杏种子样品中核苷及碱基类成分的分析为了进一步阐明银杏种子中核苷及碱基类成分的分布变化规律,所建立的方法继续被应用到从山东郯城银杏种植基地的不同树龄的银杏种子样品中核苷及碱基类成分的测定。核苷类成分总含量在100年生达到最高为1930.3μg/g,而在50年生达到最低为642.8μg/g。分析结果表明每个化合物的含量有较大的差异,腺苷、鸟苷、尿苷、2’-脱氧胞苷-5’-单磷酸、胞苷-5’-单磷酸在大部分样品中都能测到。总的来说在银杏不同部位样品中都呈现相同的趋势：碱基的含量明显高于核苷的含量。3.不同产地银杏种子样品中核苷及碱基类成分的分析采用同样的分析方法,来自不同产地的银杏种子样品中的核苷及碱基类成分的含量也被测定,结果显示鸟苷和尿苷是主要的成分而且它们的含量变化范围分别为388.7～522.7μg和86.4～415.3μg∥g。20种核苷及碱基类成分在不同区域银杏种子中的含量差异较大,例如鸟苷在许多样品中是主要的成分,最高时可达658.3μg/g,而最低时只为1.8μg/g。同时发现次黄嘌呤、黄嘌呤和5种脱氧核糖核苷类成分明显低于其他成分。此外2’-脱氧胞苷-5’-单磷酸、胞苷-5’-单磷酸、3’,5’-环磷酸腺苷也是普遍含有的成分。22批不同产地银杏种子的样品中核苷及碱基类成分的含量变化范围为772.8～1799.6gg/g。核苷及碱基类成分在不同部位、年龄、产地的银杏种子样品中被测定,结果显示腺苷、鸟苷、尿苷、腺嘌呤、鸟嘌呤在银杏种子广泛存在,尤其在银杏外种皮中含量极高。(二)氨基酸类成分资源化学评价首次建立了HILIC-UPLC-TQ/MS2分析方法用于氨基酸类成分的分析,本研究以银杏种子为例对所建立的新方法进行应用。1.不同部位银杏种子样品中游离氨基酸类成分的分析用所建立的分析方法测定了银杏种子的五个不同部位(外种皮、中种皮、内种皮、胚乳和胚芽),样品主要收集于中国银杏生产的三大主产区分别为江苏(泰兴)、山东(郯城)和广西(灵川),因此共15批银杏种子不同部位样品,测定的结果显示游离氨基酸总含量的变化范围为341.2～13136.4μg/g,五个部位中氨基酸类成分含量差异主要表现在：胚芽、胚乳、外种皮中氨基酸的含量较高而在中种皮和内种皮中氨基酸的含量较低。分析结果显示：银杏种子中氨基酸的含量积累由高到低的顺序为：胚芽>外种皮>胚乳>内种皮>中种皮。研究结果发现胚芽中游离氨基酸含量较高的是Y—氨基丁酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸；外种皮、内种皮、中种皮中含量较高的是谷氨酰胺、谷氨酸；胚乳中含量较高的是谷氨酸、γ—氨基丁酸。此外银杏外种皮和其他四个部位有很大的差别,例如在银杏外种皮中必需氨基酸和非蛋白氨基酸(Y—氨基丁酸、羟脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸)总量分别为2380.49μg/g和11729.95μg/g分别约占该部位中总氨基酸含量的7.7%和38.2%,而这两种氨基酸在其他部位中所占的比例分别为20.0～26.6%和10.7～26.9%。2.不同年龄银杏种子样品中游离氨基酸类成分的分析为了进一步阐明银杏种子中游离氨基酸类成分的分布变化规律,所建立的方法继续被应用到山东郯城银杏种植基地的不同树龄银杏种子样品中氨基酸类成分的测定,该部分的样品主要包括11个年龄(8、10、15、20、25、30、40、50、100、300、600年)的银杏种子可食部位即种仁(胚乳和胚芽)。24个游离氨基酸的含量变化范围为4330.48813.7μg/g,其中氨基酸含量最高的是谷氨酸,其次是γ—氨基丁酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。值得注意的是碱性氨基酸(精氨酸)和酸性氨基酸(谷氨酸)都是该组样品中主要的成分,非蛋白氨基酸中Y—氨基丁酸含量是其他三种非蛋白氨基酸的四倍。从分析结果中可以发现有趣的规律：银杏种子可食部位中氨基酸的含量与年龄有较大的相关性,研究结果表明从8年到40年生的银杏种子可食部位中游离氨基酸的含量呈平稳的增加直到40年达到总氨基酸含量的最高点,超过40年后总氨基酸的含量逐渐降低。3.不同产地银杏种子样品中游离氨基酸类成分的分析采用同样的分析方法不同产地的银杏种子样品中的氨基酸类成分的含量也被测定,结果显示：所有样品中都富含有氨基酸,尤其是8种必需氨基酸。分析的结果还表明银杏种子中游离氨基酸的含量具有明显的区域差异性和道地性。总氨基酸和必需氨基酸含量在来自于徐州、泰州和郯城的样品约分别是其他产区的1.5和3.5倍。Y—氨基丁酸和谷氨酸在不同产地样品中是主要成分,尤其是非蛋白氨基酸Y—氨基丁酸含量较大且具有较好的生理活性,Y—氨基丁酸是重要的神经递质、具有降血压作用现已被成功应用于开发药物和功能性食品的原料。非蛋白氨基酸中除了Y—氨基丁酸其他三个氨基酸的含量极少。除了8个必需氨基酸和4个非蛋白氨基酸以外其他12个非必需氨基酸在不同产地银杏种子样品中含量差异不明显。从营养学和功能学的角度来讲,本研究表明：银杏种子是一个营养和药用价值好的原料富含氨基酸,尤其是必需氨基酸,此外,从研究结果中也可以发现银杏种子主产区(江苏、山东)氨基酸的含量明显高于其他产区。总的来说,从氨基酸含量和作用的角度来讲银杏种子具有很好的药食同源的作用。(三)银杏种子特征性成分资源化学同时分析评价研究采用UPLC-TQ/MS2测定银杏种子特征性成分：黄酮类、银杏萜内酯、银杏酸和苯丙醇类。1.不同部位银杏种子样品中银杏萜内酯、银杏酸、黄酮类成分的分析不同部位中银杏内酯、银杏酸类成分普遍存在,但是各自成分含量差异较大,在银杏外、中、内种皮中银杏内酯含量由高到底的顺序为：银杏内酯c>银杏内酯A>银杏内酯B,胚乳和胚芽中银杏内酯含量由高到底的顺序为：银杏内酯C>银杏内酯B>银杏内酯A,该结果与系统分离结果一致。分析的结果还显示胚芽中含有极高的银杏萜内酯和白果酸,银杏外种皮中银杏酸类成分极高,而在胚乳、中种皮、内种皮中测定的成分含量较低。2.不同年龄和产地银杏种子样品中银杏菇内酯、银杏酸、黄酮类成分的分析对于白果仁受年龄和产地因素影响的分析结果发现：白果仁中所测定的26个成分含量相对都比较低,而且受年龄和产地因素的影响较小。(四)银杏多糖类成分资源化学评价1.不同部位银杏种子样品中银杏多糖类成分的分析组成银杏种子不同部位的多糖中中性多糖与酸性多糖的比为213：1～1.32：1之间,可见中性多糖为银杏种子不同部位中总多糖的重要组成部分。不同部位的样品数据显示中性多糖在不同部位中普遍要比酸性多糖高,其中中性多糖含量由高到低的顺序为：外种皮>胚乳>胚芽>内种皮>中种皮；酸性多糖含量由高到低的顺序为：外种皮>胚乳>胚芽>内种皮>中种皮；总多糖的含量由高到低的顺序为：外种皮>胚乳>胚芽>内种皮>中种皮。与其他四个部位相比银杏外种皮中总多糖的含量较高。2.不同年龄银杏种子样品中银杏多糖类成分的分析不同年龄的银杏种仁中总多糖的含量呈现出一定的趋势40年银杏总多糖的量积累达到最大值,即8～40年中总多糖的量随着年龄的增加而逐渐增加。由分析的结果可知在不同年龄的银杏种仁中中性多糖的含量呈现相对平衡的状态,而酸性多糖的量呈现出40年积累到最大值的趋势,该趋势也是直接导致银杏总多糖变化趋势形成的重要原因。3.不同产地银杏种子样品中银杏多糖类成分的分析测定结果显示：总多糖平均含量最高的为福建长汀样品达6.96%、最低的为江苏姜堰达5.18%；不同产地银杏种仁中的中性和酸性多糖的含量未见显著差异。(五)无机元素类成分资源化学评价采用ICP-AES法,对不同产地、部位、年龄银杏种子中29种无机元素含量及其分布规律进行了研究。结果显示：所有样品均显示高K低Na的元素分布特点：常量元素中K、Ca、Mg平均含量相对较高；微量元素中Fe和B平均含量相对较高.(六)脂肪酸类成分资源化学评价采用GC-MS法,对于银杏种仁中的白果油含量进行分析,结果显示白果油与常规油相比含有较多的油酸、亚油酸,其中还含有较多的不饱和脂肪酸,长期食用可预防心脑血管疾病,其开发前景很广。四、白果仁效应物质基础初步研究(一)白果仁不同提取部位及成分对小鼠哮喘模型的影响选择哮喘小鼠模型,对银杏种仁不同提取部位及成分进行评价,以肺泡灌洗液、炎细胞及病理切片等为考察指标对白果仁的传统功效敛肺化痰定喘评价。结果显示白果仁传统应用方式水煎煮部位发挥敛肺化痰定喘作用较强,而银杏种仁特征性的银杏萜内酯类成分对于敛肺化痰定喘作用较弱,所以对于银杏种仁功效物质基础还有待于进一步研究,其中水提部位是应该给予高度的重视。(二)白果仁不同提取部位对果蝇寿命的影响探讨白果仁可能具有抗衰老的提取部位,实验结果表明：白果仁水提部位与对照组以及白果仁其他提取部位相比可以延长果蝇寿命,因此白果仁传统应用方式水煎煮部位应加以重视。本论文的特色和创新点为：1.以银杏种子为研究对象,采用复合色谱分离分析方法和光谱技术,从中分离鉴定了40个化合物,包括2个新化合物,14个首次在银杏属植物中分离得到的化合物。2.采用中药资源化学的研究思路,对于不同部位、年龄、产地的银杏种子中核苷类、氨基酸类、黄酮类、萜内酯类、银杏酸类、苯丙醇类、多糖类、无机元素类、脂肪油类成分进行系统的分析评价,为客观认识和评价银杏种子提供了科学依据。建立测定核苷类、氨基酸类成分的新的分析方法。优化超声提取银杏特征性成分(黄酮类、萜内酯类、银杏酸类、苯丙醇类)的参数,并建立同时测定上述四类成分的新的分析方法。3.首次评价白果仁不同提取部位的敛肺定喘和抗衰老活性,研究结果显示白果仁水提物具有很好的活性。