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心肌细胞不停地有规律地收缩和舒张,心脏才能有效地实现泵血功能,动脉粥样硬化、炎症、栓塞、血压降低等导致心肌缺血,心脏便不能正常的工作,通过溶栓、冠状动脉搭桥、经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention,PCI)等及早地恢复心脏灌流,可能是改善临床预后的有效办法,然而心肌在恢复血流灌注后,往往出现损伤加重,即发生心肌缺血再灌注损伤。因而寻找更安全有效的方法和药物,来增强心肌细胞收缩力,改善心肌缺血再灌注损伤,显得尤为重要。映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)是从映山红花中提取的黄酮类有效部位。本课题组前期研究发现,TFR具有舒张血管,对脑缺血再灌注损伤的保护作用,抗心肌缺氧复氧损伤等作用,但有关TFR对离体心脏缺血再灌注损伤以及心肌细胞收缩性的影响尚未见报道。尾加压素Ⅱ(UII)是一种生长抑素样神经环肽,广泛表达在心血管系统,UII与其受体(UTR)结合,能够产生很多生物学作用,鉴于UT受体在缺血性心肌损伤中的作用,并且有研究表明葛根素,一种广泛治疗心脑血管疾病的黄酮类化合物,其减轻大鼠右心室肥厚的作用与抑制右心室UT受体表达有关,我们猜想,同样是黄酮类的TFR是否也是通过UT受体来发挥抗缺血性心肌损伤作用的呢?RhoA是一种小分子三磷酸鸟苷结合蛋白,RhoA通过激活下游靶分子Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK),参与多种生理功能的调节,UII与UTR结合能够激活RhoA-ROCK通路,本研究便是为了探讨TFR是否通过UTR-RhoA-ROCK通路发挥作用。本文通过Langendorff灌流装置,建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型,观察TFR对心肌缺血再灌注损伤的作用,采用配对实验设计,来探讨TFR对心肌缺血再灌注损伤作用的机制,并通过对心肌细胞收缩性的测定,来观察TFR能否增强心肌细胞收缩性从而在心肌缺血再灌注损伤中更好地发挥作用。目的:1.观察TFR对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用。2.观察TFR对心肌细胞收缩性的影响。3.探讨TFR抗大鼠离体心脏缺血再灌注损伤与UTR-RhoA-ROCK通路的关系。方法:1.采用Langendorff灌流装置建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型,观察心脏缺血再灌注过程中各组血流动力学的变化,测定各时间点冠脉流量的多少,实验结束前留取灌流液并于实验结束后保存大鼠心脏组织,以进行相应指标的检测。1.1实验共分为9组,分别为:(1)Sham组;(2)I/R模型组;(3)维拉帕米 0.02 mg/L 组;(4)Y27632(ROCK 抑制剂)1 μmol/L 组;(5)TFR 3.7 mg/L组;(6)TFR 11.1 mg/L 组;(7)TFR 33.3 mg/L 组;(8)TFR 100 mg/L 组;(9)TFR 300 mg/L组。(3-9组心脏于缺血前20 min给予含相应药物的心脏灌流液灌注)1.2测定各组大鼠离体心脏平衡20 min、给药20 min、缺血30 min、再灌注15 min、30 min、60 min各时间点血流动力学指标。1.3 E-LISA法测定心脏灌流液中LDH、CK-MB活性和cTnl含量。1.4取大鼠心脏组织,G-LISA法测定心肌组织中RhoA活性。1.5 western blot方法测定心肌组织中UTR,ROCK1和ROCK2蛋白的表达。2.采用配对实验设计的方法挑选大鼠离体心脏,应用UT受体阻断剂SB-706375和ROCK抑制剂Y27632分别阻断UT受体和ROCK通路,再次利用Langendorff灌流装置建立缺血再灌注损伤模型,测定各组血流动力学指标以及冠脉流量,实验结束前留取灌流液,并于实验结束后保存心脏组织。2.1实验分为Control组、UTR阻断组、ROCK抑制组。根据同窝别,同性别,体重相近将两只大鼠配成一对,每对中的两只大鼠心脏再随机分配到I/R组和TFR给药组,除了正常组,一直用K-H液灌注,UTR阻断组和ROCK抑制组在预处理阶段分别用含UT受体阻断剂SB-706375 10-6 mol/L和ROCK抑制剂Y27632 1μmol/L的K-H液灌注。2.2 E-LISA法测定心脏灌流液中LDH、CK-MB活性和cTnl含量。2.3 G-LISA法测定心肌组织中RhoA活性。3.原代培养新生大鼠心肌细胞,并用免疫荧光法进行鉴定。3.1用同步摄像系统(Olympus)记录细胞收缩频率。3.2计算机图像分析系统测定心肌细胞收缩幅度。3.3钙离子成像系统测定心肌细胞内钙离子荧光强度。3.4 实验分为(1)对照组;(2)TFR 3.7 mg/L 组;(3)TFR 11.1 mg/L 组;(4)TFR 33.3 mg/L 组;(5)TFR 100 mg/L 组;(6)TFR 300 mg/L 组;(7)hUII 10 nmol/L处理 48 h组;(8)hUII 100 nmol/L 处理 48 h组;(9)hUII 100 nmol/L 处理48h 组+TFR 组。结果:1.TFR对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的影响1.1在缺血再灌注损伤之前,各组左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)、冠脉流量(CF)并无统计学差异;与Sham组比较,I/R组大鼠心脏LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和CF明显下降而LVEDP明显升高;与I/R 组比较 TFR 33.3-300 mg/L 可明显升高下降的 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、CF和降低升高的LVEDP。1.2与Sham组比较,I/R组心脏灌流液中CK-MB、LDH活性与cTnl含量明显增高,与I/R组比较TFR 33.3-300 mg/L组灌流液中CK-MB、LDH活力与cTnl含量明显下降,Verapamil和Y27632组具有相类似的作用。1.3与Sham组比较,I/R组心脏组织中UTR蛋白表达显著升高,与I/R组比较,TFR 100,300 mg/L组大鼠离体心脏组织中UTR蛋白含量显著下降。1.4与Sham组比较,I/R组心脏组织中RhoA活性显著增高,给予TFR 33.3-300 mg/L后心脏组织中RhoA活性显著下降。1.5与Sham组比较,I/R组大鼠离体心脏组织中ROCK1,ROCK2蛋白含量显著升高,与I/R组比较,TFR 100,300 mg/L组大鼠离体心脏组织中ROCK1,ROCK2蛋白表达显著下降。2.UTR阻断和ROCK抑制对TFR改善大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的影响2.1在正常心脏中,与I/R组相比,100 mg/L TFR显著增加CF、LVSP和+dp/dtmax在UTR阻断心脏中,与I/R组相比,100 mg/L TFR显著增加CF,但对LVSP和+dp/dtmax却无影响,与正常心脏组比较,CF、LVSP和+dp/dtmax的差值在UTR阻断心脏组显著下降,TFR改善心功能的作用在UTR阻断条件下显著降低。2.2在正常心脏和UTR阻断心脏,与I/R组比较,100 mg/LTFR显著降低CK-MB、LDH活性和cTnl含量,然而,与正常心脏组比较,CK-MB、LDH活性和cTnl含量的差值在UTR阻断心脏组显著下降,这些结果表明TFR降低CK-MB、LDH活性和cTnl含量的能力在UTR阻断条件下下降。2.3与正常心脏组比较,在UTR阻断心脏组,TFR对RhoA活性升高的抑制率明显下降。2.4 TFR 改善心脏功能(CF、LVSP 和+dp/dtmax),降低 LDH、CK-MB 和 cTnl含量的能力在ROCK抑制条件下减弱。3.TFR对心肌细胞收缩性的影响3.1与对照组比较,hUII110,100 nmol/L作用48 h能够加快心肌细胞的收缩频率。3.2 hUII 10 nmol/L处理48 h能够增强心肌细胞收缩幅度,而hUII 100 nmol/L处理48 h降低心肌细胞收缩幅度。3.3与对照组比较,TFR 300 mg/L能够减慢心肌细胞的收缩频率。3.4与对照组比较,TFR 300 mg/L能够增加心肌细胞收缩幅度。3.5与对照组比较,TFR 33.3-300 mg/L能够减慢hUll引起的心肌细胞收缩频率的增加,与单独给予hUII 100 nmol/L预处理48 h组比较,再给予TFR 33.3-300 mg/L组能够显著增强心肌细胞的收缩幅度。3.6 hUII10,100nmol/L均能增加心肌细胞内Ca2+荧光强度;hUII100nmol/L预处理的心肌细胞再给予TFR 100 mg/L细胞内Ca2+荧光强度下降。结论:1.TFR对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤具有保护作用。2.TFR能够改善心肌细胞的收缩性。3.TFR对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用可能与其阻断UTR继而抑制RhoA-ROCK信号通路有关。