论文部分内容阅读
FMD(Foot-and-Mouth Disease ,FMD)是严重威胁世界畜牧业经济及人类健康的烈性传染病,是牛、羊、猪等主要畜种的头号杀手。该病病原FMDV(Foot-and-Mouth Disease virus,FMDV)属于小RNA病毒,具有高度的变异性和广泛的宿主谱,关于其致病的分子机制、抗原变异的分子机理和宿主嗜性,至今还不是十分清楚。为了研究其致病机制、抗原变异的分子机理和宿主嗜性,我们首次构建了FMDV牛源泛亚型O/CHINA/99株的3株不同感染性cDNA分子克隆。1. FMDV O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定设计并合成了覆盖O/CHINA/99株基因组的9条引物,从感染牛源O/CHINA/99株的乳鼠胴体中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法分别扩增出4条目的基因片段(S、C、Z和E)。利用片段两端的限制性内切酶位点,将各基因片段分别插入到pOK12载体中,构建成O/CHINA/99株基因组的全长cDNA分子克隆。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK-21细胞,24h后可观察到典型的FMDV致细胞病变效应。分别使用RT-PCR法和乳鼠皮内接种法对拯救的病毒进行鉴定,结果表明拯救到了特定的FMDV。以上鉴定结果表明,我们已成功构建了O/CHINA/99株全长感染性cDNA分子克隆,并拯救出基因工程病毒。这将为研究FMDV基因组的结构与功能、探讨PMDV的分子致病机制以及宿主嗜性奠定了良好的基础。2. FMDV O/CHINA/99缺失毒株的全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定关于PKs的功能目前尚不太清楚,有报道称PKs与FMDV的宿主嗜性和毒力有一定的关系。为揭示FMDV翻译、分子致病机制以及阐明PKs基因缺失导致的病毒宿主嗜性改变的原因,我们设计并合成了O/CHINA/99株基因组5条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,成功构建0/CHINA/99缺失毒株全长cDNA分子克隆。并拯救出0/CHINA/99特定缺失的基因工程病毒,这为进一步探索FMDV致病的分子机制及宿主嗜性奠定了良好的基础。3.嵌合病毒pOKTAW97/CHINA99的全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定IRES是蛋白翻译顺式作用元件,二级结构有4个结构域,IRES不依赖帽结构指导病毒蛋白合成。由于IRES的空间结构发生变化,而结合的宿主真核翻译起始因子不同,所以IRES在病毒翻译和宿主嗜性中发挥很重要的作用。为揭示FMDV蛋白翻译、分子致病机制以及阐明IRES空间结构改变导致的病毒宿主嗜性改变的原因,我们以牛源FMDV O/CHINA/99株的感染性cDNA为骨架,用猪源FMDV的IRES置换相应的区段,构建了FMDV型内嵌合病毒pOKTAW97/CHINA99的全长cDNA分子克隆,并得到置换IRES的嵌合病毒。这将为研究FMDV基因组的IRES的结构与功能、探讨FMDV的分子致病机制以及宿主嗜性创造了良好的条件。