金柑(Fortunella margarita (Lour.) Swingle),也称金桔、绿桔、金弹桔、金枣,原产于我国华南地区,在欧洲、日本、美国、巴西、澳大利亚、南非和印度等地区有着广泛种植。金柑营养价值很高,含有人体所需多种维生素、氨基酸以及丰富的多糖、精油、柠檬苦素、黄酮等活性物质。本文系统地研究了不同制备方法对金柑多糖结构特性的影响,金柑多糖流变学特性、热稳定性及微观构象,金柑多糖分子结构特性,金柑多糖各组分分离纯化、结构表征,并结合各组分体外降血脂构效关系,对高血脂症大鼠降血脂机理进行了研究。研究成果为金柑的高值化加工和多糖的开发利用提供了重要的理论依据,填补国内外研究空白,丰富了糖科学的研究内涵。(1)不同制备方法对金柑多糖结构特性的影响本章采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、核磁共振(1H NMR和13C NMR)和凝胶渗透色谱、多角度激光光散射与示差折光检测仪(SEC-MALLS-RI)联用技术等对热水浸提金柑多糖(WFP)、超声波辅助提取金柑多糖(UFP)、微波辅助提取金柑多糖(MFP)和超声波微波协同萃取金柑多糖(UMFP)的结构特性进行表征。结果表明,金柑多糖最佳的超声微波协同提取工艺条件为：超声波功率为131W,微波功率为105W,液料比为62mL/g,提取时间为120s,在此条件下,多糖得率为9.15±0.13%,相比传统热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法,多糖得率分别提高了405.52%、128.18%和76.64%。FT-IR、1HNMR和13C NMR分析表明,WFP、UFP、MFP和UMFP均为典型的糖类化合物,糖苷键类型以β-型糖苷键为主,并有少量的α-型糖苷键。SEC-MALLS-RI分析表明,WFP 和 UMFP分子量大部分分布在5.0×106～1.0×107g/mol范围内,分别占其总分子数量的57.80%和56.84%UFP和MFP分子量大部分分布在1.0x 106～5.0×106g/mol范围内,分别占其总分子数量的38.24%和52.39%,这表明超声波辅助和微波辅助提取法对金柑多糖分子产生了一定的降解作用,而超声波微波协同萃取法对金柑多糖结构没有产生影响。(2)金柑多糖流变学特性的研究本章对金柑粗多糖(C-FMPS)和纯多糖(P-FMPS)的静态流变学和动态流变学进行对比研究。静态流变学研究表明,盐离子的添加使金柑多糖溶液粘度降低,C-FMPS具有很好的酸碱耐受能力,而P-FMPS具有很好的耐酸能力,耐碱能力弱C-FMPS和P-FMPS溶液体系属于触变体系,且P-FMPS溶液的剪切结构恢复力要低于同浓度的C-FMPS。动态流变学研究表明,金柑多糖C-FMPS和P-FMPS结构未被破坏的线性粘弹区分别在8.55%和2.78%应变以内；在应力为2%时,P-FMPS和C-FMPS溶液的储能模量G’始终高于损失模量G”,体系以粘性为主,说明溶液体系表现为非永久性形变；在温度20-80℃范围内,随着温度的升高,多糖溶液的复合粘度逐渐降低,储能模量始终高于损耗模量,说明溶液体系主要表现为弹性行为,多糖结构未收到破坏；C-FMPS和P-FMPS溶液为剪切变稀的假塑性流体,其流动特性符合Power Law模型,且表观粘度和剪切应力随着质量浓度的增加而增大,浓度越高,溶液偏离牛顿流体越远,相同浓度条件下,P-FMPS溶液的表观粘度和剪切应力均大于C-FMPS溶液。(3)金柑多糖热稳定性及微观构象的研究本章采用差式量热扫描仪(DSC)和动杰热机械分析仪(DMA)研究C-FMPS和P-FMPS的热稳定性,采用SEC-MALLS-RI测定其分子量,采用环境扫描电镜(SEM)和激光共聚焦扫描显微镜(CSLM)观察其微观构象。结果表明P-FMPS氧化分解的温度要高于C-FMPS,且在氧化分解过程中P-FMPS释放出了较高的热量；在扫描温度为25-200℃范围内,P-FMPS的储能模量和损耗模量均高于C-FMPS的储能模量和损耗模量；P-FMPS储能模量变化平缓,而C-FMPS储能模量变化陡峭；P-FMPS损耗模量的峰型宽而平,而C-FMPS损耗模量的峰型窄而高,在高温条件下,P-FMPS较C-FMPS稳定。P-FMPS的分子量分布和相对分子量均大于C-FMPS。SEM对多糖粉末的观察表明,C-FMPS表面粗糙、紧密,无孔状结构,而P-FMPS表面较紧密、平整,大量立方孔或网状结构。CSLM对多糖溶液的观察表明,C-FMPS分子分散在溶液当中,无网络结构；而P-FMPS分子聚集,有明显的网络结构。这是由于多糖在纯化的过程中多糖分子发生了重新组合和聚集,导致P-FMPS的分子量增大。C-FMPS 和 P-FMPS分子量和微观结构的差异导致其流变学特性和热稳定性的显著差异。(4)金柑多糖分子结构特性的研究本章采用SEC-MALLS-RI联用技术系统测定多糖的分子量、分子量分布、多分散系数、均方根旋转半径、半径分布及其溶液链构象。金柑多糖重均分子量(Mw)为6.192×106(±0.814%)g/mol,多分散系数(Mw/Mn)为17.376(±7.974%),均方根旋转半径(Rw)为42.1(±9.2%)nm,这表明金柑多糖是一种高度分散的大分子聚合物；分子量分布研究表明：金柑多糖分子量主要分布在1×105-5×106g/mol范围内,占总分子质量的86.48%；峰分布表明：金柑多糖四个峰(P1、P2、P3和P4)分子分别占总分子质量的19.00%、31.60%、31.00%和18.40%,P2和P3组分(达62.6%)为金柑多糖的主要成分,其分子量分布范围为1.507×105-1.984x106g/mol,这表明金柑多糖由四个不同分子量片段的多糖组成。分子均方根旋转半径分布表明：金柑多糖分子半径主要分布在20-50nm范围内,占总分子质量的.88.79%,且分子质量与分子均方根旋转半径未成正相关性；在溶液中,金柑多糖为紧密均匀的球形构象。以上结果表明,金柑多糖是一种含有不同分子量片段的杂多糖,这将为进一步研究其分离纯化、构效关系以及功能活性作用机理提供理论依据。(5)金柑多糖分级纯化的研究本章采用DEAE Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱线性和梯度洗脱法分级纯化金柑多糖,并采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对各组分进一步分级纯化,采用HPLC色谱法和紫外-可见光谱扫描对各多糖组分进行纯度鉴定。结果表明,线性洗脱法未能将金柑多糖完全分离开来,而采用梯度洗脱法能较好的将金柑多糖各组分分离开来,得到4种不同分子量片段的多糖组分(FMPS1、FMPS2sFMPS3和FMPS4),这与金柑多糖分子结构特性的研究结果一致。纯度鉴定结果表明,1 MPS1、FMPS2、FMPS3 和 FMPS4均为分子量相对单一均匀的多糖组分；各多糖组分在260nm和280nm附近无蛋白质和氨基酸的特征吸收峰,这表明四种组分均为纯度较高的多糖。(6)金柑多糖各组分结构表征的研究本章采用FT-IR、SEC-MALLS-RI体系、1 DNMR和2DNMR等检测技术对金柑多糖各组分FMPS1、FMPS2、FMPS3 和 FMPS4的分子结构进行了表征。结果表明,FMPS1和FMPS3为果胶类多糖,FMPS1和FMPS2的糖苷键类型以α-型糖苷键为主,并有少量的β-型糖苷键,FMPS3以β-型糖苷键为主,并有少量的α-型糖苷键,FMPS4以β-型糖苷键链接而成；各组分的Mw分别为2.572×107(±0.517%)、1.755×106(±2.009%)、2.563×105(±1.784%)和2.411×105(±1.808%)g/mmol,Mw/Mn分别为1.090(±0.708%)、1.220(±2.813%)、1.124(±2.508%)和1.842(±2.509%),R.w分别为44.6(±0.8%)、33.4(±6.7%)、15.3(±27.5%)和9.4(±69.6%)nm；在溶液中,FMPS1呈现紧密均匀的球形构象,FMPS2呈现无规则线团构象,FMPS3和FMPS4为典型的高支化度聚合物；FMPS 1主要由α-Glc、α-GalA、β-Rha和p-Galp组成,其初步结构单元为-α-Glc-β-Galp-β-Rha-α-GalA-α-Glc-。FMPS4主要由α-Ara、α-Glc、β-Rha、β-Galp 和 β-Man组成,其初步结构单元为-α-Ara-β-Rha-β-Galp-α-Glc-β-Man-α-Ara-。(7)金柑多糖各组分体外降血脂作用及其构效关系的研究本章对金柑多糖各组分胰脂肪酶活性抑制、体外胆酸盐结合能力和抗氧化活性进行了研究,并将各组分活性与结构进行了对比研究。结果表明,金柑多糖FMPS1 和 FMPS3表现出了较强的胰脂肪酶活性抑制作用,这与其单糖组成和相对分子量有关；金柑多糖FMPS1和FMPS2表现出了较强的体外胆酸盐结合能力,其结合能力受到相对分子量的影响；抗氧化活性表明,FMPS3表现出了较强的抗氧化活性,FMPS4次之,FMPS1和FMPS2的抗氧化活性较弱,金柑多糖的抗氧化活性受其结构特征的影响,如：单糖组成、糖苷键类型、分子量、分子半径和溶液链构象等。金柑多糖各组分降血脂活性并不是由单一脂质代谢途径所决定,而是多途径综合影响的结果。此外,金柑多糖降血脂活性也不是单一结构因素导致的结果,而是多重结构因素相互作用的结果。(8)金柑多糖对高血脂症大鼠降血脂机理的研究本章以大鼠为研究对象,采用高脂饲料诱导大鼠形成动物脂代谢紊乱模型,以普通饲料为空白对照,以辛伐他丁为阳性对照,研究金柑多糖低剂量、中剂量和高剂量对高血脂症大鼠血清血脂水平及血浆和组织中抗氧化指标的影响。结果表明,相对于高脂模型组,金柑多糖能显著降低高血脂症大鼠血清TG、TC、LDL-C和NEFA含量,显著提高HDL-C和LIPA含量；金柑多糖可显著提高高血脂症大鼠血浆和组织中SOD、GSH-Px和GST活力及T-AOC能力,同时显著降低MDA含量,且存在一定的量效关系；此外,金柑多糖可显著降低高血脂症大鼠体重、肝脏和脾脏指数,且表现出了一定的剂量依赖性。高血脂症大鼠肝脏和血管病理学观察结果表明,金柑多糖可减少高脂血症大鼠肝细胞内脂肪沉积,对血管内皮细胞起到了一定的保护作用。这表明金柑多糖对高血脂症大鼠的血脂代谢紊乱有显著的调节作用。结合各组分体外降血脂作用构效关系的研究,金柑多糖是通过提高血浆和组织中脂肪酶活性、降低胆固醇含量和增强抗氧化酶活性等途径达到对高血脂症大鼠的降血脂作用。