脑血管疾病是临床上常见的神经系统疾病,发病率、致残率、死亡率逐年增加,其中脑出血患者死亡率相对较高。老年人是脑出血的高危人群,主要危险因素包括脑动脉粥样硬化、脑血管畸形和高血压。目前脑出血后损伤机制尚未完全阐明,也没有显著改善患者预后的治疗方法。脑出血后神经细胞凋亡是导致继发性脑损伤的一个重要因素,包括较为复杂的多种机制参与,其中有氧化应激、炎症和神经细胞凋亡等。氧化应激与出血后神经细胞凋亡密切相关。在缺氧条件下,活性氧(ROS)和NO被激活,由于脑组织高氧化代谢率和较低的抗氧化水平,易受ROS诱导,启动线粒体调亡途径。脑出血后大量自由基的产生和氧化应激损伤导致线粒体结构/功能异常,炎性介质引起白细胞粘附和聚集,阻塞微血管,进一步激活白细胞释放炎症介质和细胞因子,因此白细胞释放ROS诱导缺血性级联炎症反应导致神经细胞继发性损伤。核因子(NF)-κB是具有多种调节作用的转录因子。脑出血后氧化应激可以激活核因子(NF)-κB,诱导大量的炎性趋化因子、炎性介导细胞因子如IL-6、IL-8产生,增强转录水平,在细胞炎症和凋亡中起重要作用。既往研究表明NF-κB参与脑出血的病理生理过程,其中小胶质细胞被激活产生神经营养因子和神经毒性分子,释放大量的游离氧和细胞因子,激活NF-κB,并参与神经损伤和修复、炎症和氧化应激。C-myc具有促进细胞增殖和凋亡的双重作用:在氧化应激下,ROS激活NF-κB,启动凋亡相关基因c-myc与Max形成二聚体,进一步结合到DNA核心序列上以诱导神经细胞凋亡。因此,本研究建立了大鼠脑出血模型,观察了脑出血后氧化应激和神经细胞凋亡之间的相关性,以及凋亡相关基因c-myc的表达效应。1实验动物和分组健康雄性SD大鼠(7周龄,体重220～240g)由山东大学实验动物中心提供(证书编号SYXK-2013-0025),并饲养在SPF级实验动物房中,提供自由采食的食物和水。将雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组和MPEG-SOD组(每组N = 28)。采取自体血液输注的方法建立大鼠脑出血模型,MPEG-SOD组大鼠腹腔注射MPEG-SOD。假手术组和模型组中的大鼠接受等体积的盐水。入组大鼠用于所有实验,所有程序均经山东大学附属省立医院动物伦理委员会批准。2药物和试剂丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)购自建成生物(中国)。水合氯醛和多聚甲醛购自Kemiou Chem(中国)。兔抗NF-κ B抗体购自Boster Bio(中国)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自CST(US)。C-myc抗体购自Santa Cruz(US)。DAB染色试剂盒购自金桥(中国)。TUNEL测试试剂盒购自Roche(US)。3动物模型术前1h测量神经功能缺损评分(NDS),以排除那些具有原发性神经功能缺损的大鼠。脑出血模型是通过自体血液输血产生的,如前所述[13]。简言之,在手术前8小时禁食大鼠。在10%水合氯醛中麻醉后,将大鼠仰卧位固定,用脑立体定向仪固定大鼠头部。参考大鼠脑图谱定位尾状核,使用微加载针将从大鼠尾部静脉血管收集的50 μL动脉血(以25 μL/min速度)输注到尾状核。持续10分钟,针缓慢缩回,用骨蜡密封钻孔。切口无菌缝合。假手术组用同样方法在大鼠相同位置施加等体积的盐水。4给药MPEG-SOD组在模型制备前20分钟通过腹腔内注射MPEG-SOD(100U)。假手术组和模型组给予等体积的盐水。5动物恢复及神经行为学评估(NDS)采用Longa的5级评分法对大鼠神经功能缺损进行评价。大鼠从麻醉中清醒后,Longa评分Ⅱ级及以上为成功建立大鼠脑出血模型。术后12h、1d、3d和7d,采用Garcia评分法重新评估NDS,范围为3分～18分。6 MDA和SOD水平测定和脑组织中的水含量定量手术后12h、1d、3d和7d处死大鼠,从出血侧提取脑组织(N=7)。在4℃的预冷盐水中洗涤大鼠脑组织,并在除去表面水后称重。制备10%皮质匀浆,离心10分钟,收集上清液。蛋白质含量采用考马斯亮蓝比色法定量,MDA测定采用硫代巴比妥比色法,SOD测定采用测定黄嘌呤氧化法,严格按照试剂盒说明书进行各项操作内容,试剂盒采购于南京建成生物工程研究所。从血肿穿刺部位的后侧和前侧收集组织样品(1mm3),用于计算水含量,其定义为(湿重-干重)/湿重×100%。7 HE染色大鼠用4%多聚甲醛固定,并断头取脑。小脑、嗅球和低位脑干都被切除,剩余的脑组织浸没在多聚甲醛中。于前囟后1.4mm行冠状切片。在光场显微镜下苏木精-伊红染色观察。8免疫组织化学(IHC)染色NF-κBp65蛋白表达在所有时间点处死大鼠并提取已切除小脑和嗅球的脑,随后浸没在多聚甲醛中。制备石蜡切片(8μm)。脱蜡后,将组织切片在PBSpH7.4中漂洗三次(每次3分钟),进行抗原修复,接着用30%H2O2孵育10分钟以阻断过氧化物酶的内源性活性。加入一抗(1:1000稀释)1小时室温孵育,然后加入聚合物增强剂(20分钟室温孵育)。加入酶标记的抗小鼠/兔聚合物,室温孵育30分钟。在显微镜观察下加入新鲜制备的DAB缓冲液5分钟。苏木精用于复染和0.1%HCl分化。使用自来水冲洗载玻片,然后在梯度乙醇中脱水。加入二甲苯,随后进行树脂安装。使用Image-pro plus系统(Media Cybernetics,IPP成像分析软件corp,US)分析在光场显微镜下观察到的结果。在40X放大倍数下在血肿周围选择五个不同的视野,计算阳性表达细胞数的平均值。9 Western印迹检测c-myc蛋白在脑组织中的表达将血肿周围的大鼠脑组织在裂解缓冲液中裂解并通过离心收集溶液。应用BCA试剂盒进行蛋白质定量。通过SDS-PAGE电泳(8 μ L上样,75V 25分钟,随后用110V电泳直到溴酚蓝到达分离凝胶底部)分离蛋白质样品,并转移到PVDF膜(110V 45分钟)。将膜在封闭缓冲液中封闭1小时,随后在4℃下孵育过夜并TBST洗涤的第一抗体(1:100的抗c-myc或1:1000的抗β-肌动蛋白)孵育过夜。加入二抗(1:2000)1小时孵育。在TBST冲洗三次后,加入显影试剂在黑暗中曝光。使用Quantity One图像分析软件(BioRad,US)分析彩色条带,其相对表达式确定为目标蛋白质条带对内部参照蛋白质的吸光度值的比率。10 TUNEL测定神经组织凋亡石蜡切片脱蜡并再水化。加入蛋白酶K在室温下孵育,然后用H2 O2-甲醇封闭。将组织载玻片在PBS中漂洗两次,并在中性缓冲液(室温下1小时)中漂洗。使用过氧化氢酶室温孵育30分钟,随后进行DAB显色和甲基绿对比染色。将组织切片脱水,并在光学显微镜下观察。使用Image-pro plus系统(Media Cybernetics,IPP成像分析软件corp,US)分析在光学显微镜(10个随机选择的视野,400X放大率)下观察到的阳性细胞的总数。11统计方法使用SPSS20.0软件进行统计分析。首先测试数据的正态性分布,符合正态分布用平均值±标准差表示。单因素方差分析(ANOVA)进行多组间比较,两两比较应用LSD方法。p<0.05为统计学有显著差异。结果1 NDS评分假手术组中没有观察到大鼠肢体麻痹,并对肢体末端的疼痛刺激反应灵敏,因此NDS评分0级。模型组和治疗组大鼠均有脑血肿对侧肢体麻痹,行走呈"追尾"步态,两组大鼠提取的脑组织均可见到明显的圆形血肿。4例死于围手术期感染或蛛网膜下腔出血大鼠及4例术后NDS评分0级大鼠均从测试队列中剔除。脑出血的评估见图1。假手术组中大鼠没有发现明显的行为改变。模型组大鼠神经功能缺陷明显,且术后3dNDS评分最高。与模型组相比,MPEG-SOD组大鼠在术后12h、1d、3d和7d的NDS评分均差异显著,有统计学意义(p<0.05,图2)。2手术后脑组织水肿假手术组大鼠脑组织没有观察到明显的水肿。模型组大鼠术后有脑水肿,术后3d达峰值并逐渐减轻。MPEG-SOD组与模型组相比,所有时间点脑水肿均明显减轻(p<0.05,图3)。3大鼠脑组织形态HE染色和光学显微镜观察,假手术组大鼠脑组织没有观察到明显变化,脑组织排列规整、形态完整,细胞数量和结构正常。模型组大鼠在所有时间点均观察到脑组织不规则的神经细胞排列,不同程度的神经细胞肿胀,并伴有炎性细胞浸润和胶质增生,最严重的病理损伤发生在术后3d。与模型组相比,MPEG-SOD组大鼠脑组织损伤在所有时间点均明显减轻(图4)。4脑组织的MDA和SOD水平与假手术组相比,模型组大鼠在术后的所有时间点MDA水平均显著升高及SOD水平均显著降低(p<0.05)。与模型组相比,MPEG-SOD组大鼠MDA水平显著降低和SOD水平显著升高(p<0.05,图5)。5 NF-κBp65蛋白表达检测NF-κBp65蛋白的阳性表达位于细胞核和细胞质中,如棕色颗粒所示。假手术组大鼠脑组织中NF-κBp65的阳性表达较少。而模型组大鼠在术后12h NF-κ Bp65阳性表达升高,3d达峰值,NF-κ Bp65阳性表达持续至术后7d。与模型组相比,MEPG-SOD组NF-κBp65阳性表达在所有时间点均明显降低(图6)。6 TUNEL神经细胞凋亡大多数TUNEL阳性细胞位于神经细胞核内部,如棕黄色所示。与假手术组相比,模型组TUNEL阳性比率相对较高,在术后3d达到峰值,然后逐渐减少。MPEG-SOD组与模型组相比在所有时间点TUNEL阳性比率均显著降低(图7和图8)。7 Western印迹检测c-myc蛋白在脑组织中的表达在术后的所有时间点,模型组大鼠脑组织中的c-myc蛋白表达水平显著高于假手术组(p<0.05),模型组大鼠在术后3d脑组织c-myc蛋白表达达峰值,而MPEG-SOD组在所有时间点与模型组相比均具有较低的c-myc蛋白表达(p<0.05,图 9 和图 10)。结论1、脑出血后脑组织氧化应激产物MDA水平升高,SOD水平降低,提示脑出血后氧化应激状态明显。2、脑出血后脑组织NF-κBp65蛋白术后12h表达增加,3d达峰值,术后7d,NF-κ Bp65阳性表达仍然可见。提示出血后氧化应激诱导NF-κ B的活化,且持续时间长,可能是继发性脑损伤的重要环节。c-myc蛋白的表达与TUNEL-阳性细胞数一致,术后3d达到峰值,然后逐渐减少。提示脑出血后氧化应激诱导的神经细胞凋亡可能与NF-κ B的活化和凋亡相关基因c-myc的启动相关。3、抗氧化物MPEG-SOD可抑制脑出血后氧化应激状态,降低NF-κ B及c-myc蛋白的表达,减少神经细胞凋亡,可能为减轻继发性脑损伤提供一个新的治疗思路。