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背景与目的：
膀胱癌(Bladder cancer)是泌尿生殖系统常见恶性肿瘤。临床上，膀胱癌中约为80％为上皮细胞癌，其中70～80％为非肌层浸润性膀胱癌，对该类患者的标准治疗方案为经尿道膀胱肿瘤切除术并结合术后膀胱原位灌注化疗或免疫治疗。常规化疗药物顺铂(Cisplatin，DDP)，早在1978就被美国FDA批准使用并广泛地应用于膀胱癌的治疗，然而患者在化疗过程中易出现原发性或获得性耐药，以及出血性膀胱炎、甚至是全身系统毒性如骨髓抑制等毒副作用，因此，寻求更为安全有效的治疗药物，减少膀胱癌原位灌注治疗引发的毒副作用显得尤为重要。
白藜芦醇(Resvertrol，RV)为富含于葡萄、花生等多种植物中的天然多酚类化合物。目前己发现RV具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，且在治疗剂量下对机体并无明显的毒副作用。这些特点对于RV与常规肿瘤化疗药物的联合使用提供了良好的先决条件。大量研究表明RV本身就具有抗肿瘤活性，还可与吉非汀、顺铂等化疗药物联合应用有效的对抗乳腺癌、肺癌等多种癌症。RV和顺铂联合应用能否有效拮抗膀胱癌的耐药性?RV自身或代谢为某种活性形式发挥抗癌作用?白藜芦醇发挥抗癌作用的关键活性基团等问题都有待于阐释，进而为合理用药、肿瘤个性化治疗和开发稳定有效的候选药物提供可靠前期基础。
材料与方法：
不同浓度的DDP或RV(单独或联合应用)处理人膀胱癌T24和EJ细胞，采用显微镜下观察、H&E染色、MTT活性检测、划痕实验及流式细胞术等方法对DDP、RV或两者联合应用的抗肿瘤活性作用、形态学变化、侵袭作用进行检测和分析，并利用Western blot、RT-PCR、qRT-PCR等分子生物学技术从分子水平进行机制研究和探讨。随后，对天然产物RV单独处理细胞的抗肿瘤活性情况进行检测，并通过高效液相色谱(HPLC)、液质联用技术(LC/MS/MS)及高分辨质谱技术(HRMS)，定性和定量分析RV在肿瘤细胞中经代谢后的主要代谢产物及各代谢产物在所有化合物中的含量或比例。此外，体外原代培养正常大鼠膀胱的移行上皮细胞，对细胞存活和形态学变化等判定治疗剂量下的RV对正常大鼠移行上皮细胞是否具有毒性作用。最后，同样应用上述实验技术对RV及其衍生物进行定性和定量分析，检测各化合物对敏感细胞的抗肿瘤活性及其代谢形式，并进行RV构效关系的分析。
结果：
一、RV在DDP敏感性不同的两种膀胱癌细胞中的活性评估及其机制研究
膀胱癌T24和EJ细胞对RV和DDP呈现相似的差异敏感性，即在T24细胞中较为敏感而在EJ细胞中相对耐受。RV与DDP联合应用降低了DDP在T24细胞中促进分化，抑制生长和降低侵袭的有效作用浓度，发挥协同增效作用。RV与DDP联合用药拮抗EJ细胞对DDP的耐药性，抑制EJ细胞生长并降低其侵袭作用。RV与DDP联合用药均可通过降低耐药蛋白MRP2的表达，直接损伤细胞DNA，激活ATM/ATR及其下游Chk1/2蛋白磷酸化，导致降低下游DNA修复酶PARP-1、调控抑癌基因p53和p21、促进cleaved化Caspase-3增加，进而发挥抗膀胱癌细胞的活性作用。
二、RV在人膀胱癌细胞T24、EJ中敏感性差异与其代谢形式的相关性研究
敏感性差异的T24和EJ细胞代谢RV后产生相同的代谢产物，且白藜芦醇单硫酸酯为主要代谢产物形式。RV相关代谢酶SULT1A1的表达在两种细胞中均有不同程度的增加。体外转化RVS对敏感的T24细胞并无显著的细胞形态影响和抑制细胞增殖作用。培养基中的酚红是否存在对RV在T24细胞中的抗癌活性及代?谢情况无明显影响。治疗剂量的RV对原代培养的正常大鼠上皮细胞并无明显抑制作用和导致细胞形态变化的毒性作用。
三、RV衍生物在敏感性人膀胱癌T24细胞中的代谢活性及其构效关系的研究
RV的衍生物中除白藜芦醇苷外，氧化白藜芦醇、乙酰化白藜芦醇均以时间和剂量依赖方式抑制T24细胞生长，抑制作用强弱次序为氧化白黎芦醇＞乙酰化白藜芦醇＞RV＞白藜芦醇苷。上述化合物处理T24细胞后，在细胞上清液、存活以及死亡细胞内检测到的代谢产物均相同。经细胞代谢后，RV、氧化白藜芦醇和乙酰化白藜芦醇仍以原型为主，而乙酰化白藜芦醇主要代谢成RV发挥作用。
结论：
一、膀胱癌T24和EJ细胞对RV和DDP呈现相似的差异敏感性，即在T24细胞中较为敏感而在EJ细胞中相对耐受;
二、RV与DDP联合用药，通过调控MRP2及DNA损伤信号通路对T24细胞可协同增效，而对EJ细胞可逆转耐药;
三、RV在敏感性差异的T24和EJ细胞中的代谢产物和代谢方式基本相同，其抗膀胱癌的主要活性形式主要为RV自身、而非其代谢产物RVS;
四、T24、EJ细胞对RV敏感性差异，与其相关代谢酶及其雌激素样作用无关联性;
五、治疗剂量RV对原代培养的大鼠上皮细胞无明显的毒副作用;
六、RV及其衍生物构效关系表明，RV生物活性与其母核上游离酚羟基的数目、位置直接相关，尤其3-OH或4-OH，且保留或保护更多游离酚羟基具有更强的药理活性。
膀胱癌(Bladder cancer)是泌尿生殖系统常见恶性肿瘤。临床上，膀胱癌中约为80％为上皮细胞癌，其中70～80％为非肌层浸润性膀胱癌，对该类患者的标准治疗方案为经尿道膀胱肿瘤切除术并结合术后膀胱原位灌注化疗或免疫治疗。常规化疗药物顺铂(Cisplatin，DDP)，早在1978就被美国FDA批准使用并广泛地应用于膀胱癌的治疗，然而患者在化疗过程中易出现原发性或获得性耐药，以及出血性膀胱炎、甚至是全身系统毒性如骨髓抑制等毒副作用，因此，寻求更为安全有效的治疗药物，减少膀胱癌原位灌注治疗引发的毒副作用显得尤为重要。
白藜芦醇(Resvertrol，RV)为富含于葡萄、花生等多种植物中的天然多酚类化合物。目前己发现RV具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，且在治疗剂量下对机体并无明显的毒副作用。这些特点对于RV与常规肿瘤化疗药物的联合使用提供了良好的先决条件。大量研究表明RV本身就具有抗肿瘤活性，还可与吉非汀、顺铂等化疗药物联合应用有效的对抗乳腺癌、肺癌等多种癌症。RV和顺铂联合应用能否有效拮抗膀胱癌的耐药性?RV自身或代谢为某种活性形式发挥抗癌作用?白藜芦醇发挥抗癌作用的关键活性基团等问题都有待于阐释，进而为合理用药、肿瘤个性化治疗和开发稳定有效的候选药物提供可靠前期基础。
材料与方法：
不同浓度的DDP或RV(单独或联合应用)处理人膀胱癌T24和EJ细胞，采用显微镜下观察、H&E染色、MTT活性检测、划痕实验及流式细胞术等方法对DDP、RV或两者联合应用的抗肿瘤活性作用、形态学变化、侵袭作用进行检测和分析，并利用Western blot、RT-PCR、qRT-PCR等分子生物学技术从分子水平进行机制研究和探讨。随后，对天然产物RV单独处理细胞的抗肿瘤活性情况进行检测，并通过高效液相色谱(HPLC)、液质联用技术(LC/MS/MS)及高分辨质谱技术(HRMS)，定性和定量分析RV在肿瘤细胞中经代谢后的主要代谢产物及各代谢产物在所有化合物中的含量或比例。此外，体外原代培养正常大鼠膀胱的移行上皮细胞，对细胞存活和形态学变化等判定治疗剂量下的RV对正常大鼠移行上皮细胞是否具有毒性作用。最后，同样应用上述实验技术对RV及其衍生物进行定性和定量分析，检测各化合物对敏感细胞的抗肿瘤活性及其代谢形式，并进行RV构效关系的分析。
结果：
一、RV在DDP敏感性不同的两种膀胱癌细胞中的活性评估及其机制研究
膀胱癌T24和EJ细胞对RV和DDP呈现相似的差异敏感性，即在T24细胞中较为敏感而在EJ细胞中相对耐受。RV与DDP联合应用降低了DDP在T24细胞中促进分化，抑制生长和降低侵袭的有效作用浓度，发挥协同增效作用。RV与DDP联合用药拮抗EJ细胞对DDP的耐药性，抑制EJ细胞生长并降低其侵袭作用。RV与DDP联合用药均可通过降低耐药蛋白MRP2的表达，直接损伤细胞DNA，激活ATM/ATR及其下游Chk1/2蛋白磷酸化，导致降低下游DNA修复酶PARP-1、调控抑癌基因p53和p21、促进cleaved化Caspase-3增加，进而发挥抗膀胱癌细胞的活性作用。
二、RV在人膀胱癌细胞T24、EJ中敏感性差异与其代谢形式的相关性研究
敏感性差异的T24和EJ细胞代谢RV后产生相同的代谢产物，且白藜芦醇单硫酸酯为主要代谢产物形式。RV相关代谢酶SULT1A1的表达在两种细胞中均有不同程度的增加。体外转化RVS对敏感的T24细胞并无显著的细胞形态影响和抑制细胞增殖作用。培养基中的酚红是否存在对RV在T24细胞中的抗癌活性及代?谢情况无明显影响。治疗剂量的RV对原代培养的正常大鼠上皮细胞并无明显抑制作用和导致细胞形态变化的毒性作用。
三、RV衍生物在敏感性人膀胱癌T24细胞中的代谢活性及其构效关系的研究
RV的衍生物中除白藜芦醇苷外，氧化白藜芦醇、乙酰化白藜芦醇均以时间和剂量依赖方式抑制T24细胞生长，抑制作用强弱次序为氧化白黎芦醇＞乙酰化白藜芦醇＞RV＞白藜芦醇苷。上述化合物处理T24细胞后，在细胞上清液、存活以及死亡细胞内检测到的代谢产物均相同。经细胞代谢后，RV、氧化白藜芦醇和乙酰化白藜芦醇仍以原型为主，而乙酰化白藜芦醇主要代谢成RV发挥作用。
结论：
一、膀胱癌T24和EJ细胞对RV和DDP呈现相似的差异敏感性，即在T24细胞中较为敏感而在EJ细胞中相对耐受;
二、RV与DDP联合用药，通过调控MRP2及DNA损伤信号通路对T24细胞可协同增效，而对EJ细胞可逆转耐药;
三、RV在敏感性差异的T24和EJ细胞中的代谢产物和代谢方式基本相同，其抗膀胱癌的主要活性形式主要为RV自身、而非其代谢产物RVS;
四、T24、EJ细胞对RV敏感性差异，与其相关代谢酶及其雌激素样作用无关联性;
五、治疗剂量RV对原代培养的大鼠上皮细胞无明显的毒副作用;
六、RV及其衍生物构效关系表明，RV生物活性与其母核上游离酚羟基的数目、位置直接相关，尤其3-OH或4-OH，且保留或保护更多游离酚羟基具有更强的药理活性。