论文部分内容阅读
目的组分复方OQV-e由荭草苷（Orientin,Ori）、槲皮苷（Quercitrin,Que）、牡荆素（Vitexin,Vit）组成,本课题组前期研究发现,其最佳配伍比例为 Ori 12.55μmol/L、Que 39.99μmol/L、Vit 19.99μmol/L,并验证其可能通过调控自噬达到抗H9c2细胞缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）损伤的作用,但具体作用机制以及Ori、Que及Vit之间的协同作用机制尚不明确。因此,本实验应用蛋白质组学研究OQV-e抗H9c2细胞H/R损伤的作用机制,继而应用Western Blot及分子对接技术探究Ori、Que及Vit之间的协同作用机制。方法与结果1.OQV-e对H9c2细胞H/R损伤的保护作用及蛋白质组学研究药效学检测指标及方法:细胞分组:正常组、模型组、OQV-e组、Ori组、Que组、Vit组。CCK-8法检测H9c2细胞存活率;LDH法检测H9c2细胞损伤率;Hochest 33258荧光染色观察H9c2细胞凋亡情况。结果:OQV-e组H9c2细胞数量比Ori组、Que组及Vit组增多,空泡较少,细胞排列较规则,细胞形态和轮廓也较为清晰。OQV-e、Ori、Que及Vit均可提高H/R损伤H9c2细胞存活率,OQV-e提高效果显著（p＜0.05）;OQV-e、Ori、Que及Vit均可显著降低H/R损伤H9c2细胞损伤率（p＜0.001）,OQV-e组H9c2细胞的损伤率显著低于Ori组、Que组及Vit组（p＜0.01）;对H9c2细胞凋亡情况进行观察,OQV-e组细胞正常数量较Ori组、Que组及Vit组多,凋亡数量较Ori组、Que组及Vit组少。Lable-free蛋白质组学研究:细胞分组:正常组、模型组、OQV-e组。采用LC-MS/MS联用技术进行Lable free蛋白质组学分析,使用Mascot搜索引擎在Uniprot大鼠蛋白质数据库完成蛋白质的鉴定;通过计算质谱峰面积法进行蛋白定量,筛选p＜0.05为差异表达蛋白。对差异表达蛋白进行COG分析、GO分析和KEGG分析,筛选关键通路及蛋白。结果:共鉴定到肽段数21057个,蛋白质数3481个,正常组与模型组比较共有差异表达蛋白496个,模型组与OQV-e组比较共有差异蛋白460个,正常组与OQV-e组比较共有差异蛋白248个。COG分析结果显示基因功能大多集中在:信号转导机制、变性后修饰,蛋白质转换,分子伴侣、细胞内转运,分泌和囊泡运输、细胞骨架、能源生产和转换等。GO分析发现差异蛋白的主要生物过程有:细胞内蛋白质的运输、蛋白质折叠、蛋白质的稳定、内质网到高尔基体等;主要的细胞组分有:胞质、线粒体、细胞质的核周围区域、核浆等;主要的分子功能有:ATP结合、GTP结合、GTP酶活性、泛素蛋白连接酶结合、酶结合等。KEGG通路富集分析,发现OQV-e参与的靶标路径包括:细胞外基质-受体相互作用、PI3K/Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、溶酶体、线粒体自噬等20条。2.基于蛋白免疫印迹技术研究OQV-e抗H9c2细胞H/R损伤作用机制线粒体自噬通路:OQV-e可降低H/R损伤H9c2细胞的PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、SQSTM1/p62、Nbr1、Tax1bp1、Tbc1d15 蛋白的表达水平。PI3K/Akt信号通路:OQV-e可降低H/R损伤H9c2细胞的PI3K、p-PI3K、Akt、Igf1r、Lamα5、Itgα5、Itgβ1 蛋白表达水平,升高 p-Akt及NF-κB蛋白表达水平。3.Ori、Que及Vit在OQV-e抗H9c2细胞H/R损伤中的协同机制研究3.1基于蛋白免疫印迹技术研究Ori、Que、Vit在OQV-e抗H9c2细胞缺H/R损伤中的协同作用机制线粒体自噬通路:本实验结果显示,Ori、Que及Vit处理的H/R损伤H9c2细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Nbr1及Tax1pb1蛋白的表达与模型组相比均呈降低趋势,但差异不显著,OQV-e处理的H/R损伤H9c2细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Nbr1及Tax1pb1蛋白表达水平均显著降低（p＜0.05）;在p62蛋白表达中,Ori组结果和模型组相比差异不显著,Que组和Vit组于模型组相比具有显著差异（p＜0.05）,OQV-e组与模型组相比具有极显著性（p＜0.001）。PI3K/Akt信号通路:本实验中Ori、Que及Vit可降低H/R损伤H9c2细胞的Itgα5表达水平,但差异不显著,OQV-e可显著降低Itgα5表达水平（p＜0.01）;Que与Vit可显著下调H/R损伤H9c2细胞的Lamα5表达水平（p＜0.05）,但Ori组差异不显著,OQV-e组细胞的Lamα5表达水平显著下降（p＜0.05）。3.2基于分子对接技术探索Ori、Que、Vit在OQV-e抗H9c2细胞缺H/R损伤中的协同作用机制方法:利用Autodock vina软件将Ori、Que及Vit分别与蛋白质组学筛选获得的差异蛋白进行分子对接,预测OQV-e抗H9c2细胞H/R损伤的可能机制。结果:与Ori、Que、Vit均具有强烈结合活性的靶点有:Acvr1、Itga5、Nhp211、Stat6、Ncoa4、Rbm8a、Tgfbr2、Plxna1、Hmox1、Acp2、Sort1、Gusb、Epha4、Tgfb3、Ctsa、Fzd2、Pold1、Itgb6。结论1.OQV-e可能通过PI3K/Akt/NF-κB通路抑制线粒体自噬保护H/R损伤H9c2细胞。2.Ori、Que及Vit通过协同作用于线粒体自噬通路的LC3、p62、Nbr1 及 Tax1pb1 蛋白,以及 PI3K/Akt 通路的 Itgα5、Lamα5 蛋白,继而调控线粒体自噬和PI3K/Akt通路以减轻H9c2细胞H/R损伤。3.Ori、Que、Vit起协同作用的其他可能靶点:Acvr1、Nhp211、Stat6、Ncoa4、Rbm8a、Tgfbr2、Plxna1、Hmox1、Acp2、Sort1、Gusb、Epha4、Tgfb3、Ctsa、Fzd2、Pold1、Itgb6。