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目的
在全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)的作用下,研究小鼠大脑皮层神经元细胞p38MAPK、SRC-3的磷酸化改变以及SRC-3的降解与RARα的转录激活活性之间的关系。
方法
取16天正常孕鼠胚胎进行大脑皮层神经元细胞的剥离并利用NEOCORTICAL CELLDISSECTION的培养方法进行神经元细胞的原代培养。待细胞生长密度至80%左右时:
1.用ATRA干预细胞不同时间后,利用Western-immunoblotting检测p38MAPK和SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3和RARα的蛋白总量;利用凝胶滞留电泳(ElectrophoreticMobility Shift Assay,EMSA)技术检测RARα的转录激活活性;采用半定量RT-PCR技术检测HOXd3基因表达情况;
2.选取关键时间点16h,同时给予ATRA和泛素-蛋白酶体抑制剂MG 132干预细胞,利用Western-immunoblotting检测SRC-3的蛋白总量;
3.选取关键时间点16h,同时给予ATRA和p38MAPK抑制剂SB203580干预细胞,利用Western-immunoblotting检测SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3和RARα的蛋白总量;利用EMSA检测RARα的转录激活活性;采用半定量RT-PCR技术检测HOXd3基因表达情况;
4.选取关键时间点16h,同时给予ATRA和ERK(p42/44)MAPK抑制剂PD98059干预细胞,利用Western-immunoblotting检测SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3的蛋白总量。
结论
1.ATRA引起了神经元细胞p38MAPK和SRC-3的磷酸化,而且,SRC-3的磷酸化依赖于p38MAPK途径;
2.ATRA作用于神经元细胞后,SRC-3磷酸化后成为泛素.蛋白酶体的作用靶标,被泛素-蛋白酶体识别并降解;SRC-3的降解依赖于p38MAPK途径;
3.在ATRA作用神经元细胞起始阶段,p38MAPK通过磷酸化SRC-3,使SRC-3与RARα之间相互作用增强,从而增强了RARα的转录激活活性。但是,p38MAPK的抑制剂在该事件后期却可以促进RARα的转录激活活性,可能是由于抑制了SRC-3的降解或者涉及其他机制从而促进RARα的转录激活活性;
4.ATRA通过p38MAPK途径,调节RARα的转录激活活性,并且诱导下游分化基因HOXd3的表达。