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大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，主要有以下几个优势：(1)遗传背景和生理特性较为清晰，已有很多不同抗药性、不同营养依赖型和不同校正突变型的菌种供选择应用，可以根据不同的载体而选择相应菌株；(2)生长速度快，20～30min可繁殖一代，可进行大规模发酵培养，表达周期短；(3)表达水平高，且下游工艺简单、易于控制；(4)基因工程方法已趋于完善，操作简单，且已有大量可供选择利用的表达载体：(5)生产及表达外源蛋白的培养基廉价。基于大肠杆菌具有以上优势，本研究将利用原核表达体系构建人Kallistatin及衣原体HSP60重组体，转化进大肠杆菌BL2l(DE3)株中，实现其在原核体系中的表达。
Kallistatin同PEDF、Amithrombin、Maspin一样，属丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Sefine protease inhibitor，Serpin super family)，同时也是激肽释放酶．激肽系统(kallikrein-kinin system,KKS)的重要组成部分。但它有独立于激肽释放酶-激肽系统的多重的血管功能，例如Kallistatin能够调节血压，诱导主动脉环舒张，减少肾脏灌注压，刺激血管平滑肌细胞的增殖与迁移。而且研究证明Kallistatin在体外能够抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和黏附，促进血管内皮细胞凋亡，在体内能够抑制一些疾病模型中的病理性血管增生。由此可见，Kallistatin可能成为治疗血管增生性疾病的有力候选药物。
HSP60不仅作为分子伴侣在蛋白质正确折叠中起着关键性作用，同时它参与自身免疫性疾病、慢性炎性疾病、内分泌系统性疾病、心肌炎及动脉硬化等临床疾病的发生和发展。人HSP60(hHSP60)与衣原体HSP60(cHSP60)氨基酸序列的同源性为48％。cHSP60具有高度的免疫原性，除激发机体产生抗cHSP60抗体外，亦可引起细胞免疫应答。研究证明沙眼衣原体感染引起输卵管炎症与免疫反应密切相关，cHSP60诱发人体产生免疫应答反应，并产生抗cHSP60抗体，抗cHSP60保守决定簇的抗体也能与hHSP60发生免疫反应。这种对HSP60保守抗原决定簇的自身免疫应答引起局部免疫反应成为导致女性输卵管损伤的关键因素。本研究的目的是得到有活性的Kailistatin和cHSP60基因工程重组蛋白，为后续功能研究打下基础。第一部分将kallistatin目的基因分别定向克隆入四种原核表达载体pET-28a(+)／pET-30a-c(+)／pET-22b(+)／pGEX-4T-l中，并用IPTG诱导其表达，从而获得具有生物学活性的重组蛋白；第二部分将cHSP60目的基因定向克隆入原核表达载体pET-28a(+)中，用IPTG诱导其表达，以期获得具有生物学活性的重组蛋白。
第一部分：重组人激肽释放酶抑素(Kallistatin)的构建与表达
研究方法：
1.Kallistatin在原核表达载体中的构建：根据GeneBank中人源性kallistatin cDNA的序列(NM 006215)设计引物。通过RT-PCR的方法从人肝组织中获得kallistatin的eDNA。再以kallistatin的cDNA为模板，扩增目的基因，并将该基因分别定向克隆入表达载体pET-28a(+)、pET-30a-c(+)、pET-22b(+)和pGEX-4T-1中，在重组体pET-28a(+)／kallistatin及pET-30a-c(+)／kallistatin 中，插入位点的5’端具有编码6个组氨酸的序列；在重组体pET-22b(+)／kallistatin中，插入位点的3’端具有编码6个组氨酸的序列；在重组体pGEX-4T-l／kallistatin中，插入位点的5’端具有编码GSI的序列。将重组体转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)中。用PCR、限制性核酸内切酶双酶切和DNA测序鉴定以上重组体连接的准确性及读码框架的正确性。
2.Kallistatin重组体在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及鉴定：采用CaCl2法将重组体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，建立表达人Kaliistatin重组融合蛋白的工程菌株。IPTG诱导表达后，根据不同的载体选择固化Ni2+-NTA Resin亲和层析方法或Glutathione SepharoseTM4B亲和层析方法纯化重组蛋白；SDS-PAGE和Western-blot鉴定Kallistatin重组蛋白及纯度。
研究结果：
1.通过RT-PCR的方法成功地从人肝组织中扩增出目的基因片段，长度为1284bp；PCR、双酶切及测序结果表明重组体pET-28a(+)/kallistatin、pET-30a-c(+)／kallistatin、pET-22b(+)／kallistatin及pGEX-4T-1／kallistatin连接无误，读码框架正确，目的基因仅在第669位有一个同义突变，对其读码框架无影响，四个重组体均构建成功。
2.经SDS-PAGE和Western-blot分析，重组体pET-28a(+)／kallistatin和pET-30a-e(+)／kallistatin不能表达Kallistatin蛋白；重组体pET-22b(+)／kallistatin能表达Kallistatin蛋白，但主要存在于不可溶部分，经变性复性后获得极少量纯度较低的可溶Kallistatin蛋白；重组体pGEX-4T-1／kallistatin可表达少量可溶Kallistatin蛋白。Kallistatin在pET系统表达效果不理想。
第二部分：衣原体热休克蛋白60(cHSP60)的构建与表达研究方法：
1.cHSP60在原核表达载体中的构建：根据GeneBank中Chlamydia trachomatisD／UW-3／CX HSP60的编码序列(AE001273.1)设计引物。以沙眼衣原体基因组DNA为模板，经PCR扩增cHSP60目的基因，并将该基因定向克隆入表达载体pET-28a(+)中，在重组体pET-28a(+)／cHSP60中，插入位点的5’端具有编码6个组氨酸的序列；重组体采用CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)中。经PCR、限制性核酸内切酶双酶切和DNA测序鉴定重组体连接的准确性及读码框架的正确性。
2.cHSP60重组体在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及鉴定：重组体采用CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，建立表达criSP60重组融合蛋白的工程菌株。用IPTG诱导其表达，固化Ni2+-NTA Resin亲和层析方法纯化目的蛋白；SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定cHSP60重组蛋白及纯度；DC法进行蛋白浓度的测定。
研究结果：
1.PCR、双酶切及测序结果表明重组体pET-28a(+)／cHSP60连接无误，读码框架正确，目的基因无突变，重组体pET-28a(+)／cHSP60构建成功。
2.经SDS-PAGE和Westem-blot分析，用IPTG诱导后重组体pET-28a(+)／cHSP60在约60KD处有大量可溶蛋白表达，凝胶灰度扫描结果显示纯化后重组蛋白纯度可达90％以上。每升菌液约可得到纯化的可溶cHSP．60重组蛋白18mg。
结论及研究意义：
1.构建并获得四个人Kallistatin原核表达重组体pET-28a(+)／kallistatin、pET-30a-c(+)／kallistatin、pET-22b(+)／kallistatin及pGEX-4T-1／kallistatin；对人Kallistatin在大肠杆菌不同原核表达载体中表达进行了尝试与探索，表达效果不理想。
2.成功构建可表达cHSP60重组蛋白的大肠杆菌工程菌株pET-28a(+)／cHSP60／BL21(DE3)，并获得大量的可溶性基因工程纯化蛋白cHSP60，蛋白纯度达90％以上，每升菌液约可得到18mg的cHSP60重组蛋白，为后续研究提供了基础；同时建立了一套高效、稳定、可靠的蛋白纯化路线和方法。
3.不同基因原核表达效率存在差异，pET体系适用于cHSP60基因的表达，而不适用于kallistatin基因的表达。