研究目的胰腺癌(Pancreatic cancer, PC)的发病率逐年上升，目前其致死率己位居消化道恶性肿瘤第二位。胰腺癌的早期诊断十分困难，治疗效果及预后极差，而癌痛为胰腺癌患者最常见和最难忍受的首发症状之一。胰腺癌患者的疼痛发生率及其严重程度与肿瘤程度相关，随肿瘤的恶化进展而明显升高，患者死亡前的癌痛发生率高达90%以上，部分患者对癌痛的恐惧甚至超过对死亡的恐惧。因此，癌痛控制已成为患者的第一需要和构成胰腺癌姑息治疗不可缺少的重要组成部分，但遗憾的是，目前各种针对胰腺癌痛的治疗效果不明显或不一致。因此，对胰腺癌痛的发生及发展机制进行探讨，以求开发新的胰腺癌镇痛疗法，已成为临床急需解决的难题之一。本课题组前期的研究发现，胰蛋白酶(trypsin)在胰腺癌中释放增加，进而通过行为学和电生理实验证明其可激活蛋白酶活化受体2(Protease-activated receptor-2,PAR2)，进一步增敏TRPV1在胰腺癌疼痛中发挥重要调节作用，为认识胰腺癌痛的机制提供了新的实验证据。为了进一步探讨胰腺癌疼痛发生和发展过程中神经病理性炎症发生的来源及细胞分子生物学调控机制，本课题拟在前期实验的基础上，进一步通过收集临床胰腺手术标本，观察其中肥大细胞的数目及其脱颗粒产物的变化及其在疼痛发生维持中的作用与机制。目前的研究表明，肥大细胞(Mast cells, MCs)在慢性胰腺炎、炎症性肠病及间质性膀胱炎等疾病中有聚集和激活的趋势，并与内脏痛显著相关。肥大细胞在胰腺癌中也有聚集激活的趋势，但其与疼痛的相关性鲜有提及；同时，临床上的胰腺癌痛与肿瘤大小、位置等均无明确对应关系，肿瘤周围微环境变化可能在疼痛发生中起到重要作用。我们认为MCs在人胰腺癌的顽固性疼痛中也发生了激活，并通过组织学染色和对其特异性脱颗粒产物组胺、类胰蛋白酶与NGF使用定量的方法加以验证。辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid1, TRPV1)在胰腺癌疼痛以及多种内脏痛中都发挥关键的作用，在人慢性胰腺炎和胰腺癌中有过表达，且胰腺癌的肿瘤细胞及癌周神经细胞都表现出TRPV1免疫反应性，且阳性率与痛觉评分相关。以上研究结果提示，以MCs为源头的PAR2与TRPV1激活，可能是胰腺癌痛发生维持的重要机制之一。本研究重点关注MCs及其脱颗粒产物对TRPV1的作用，着眼于上述可能的伤害性感受传导机制，通过临床研究、整体动物以及细胞水平的实验来探讨这条信号通路在导致胰腺癌痛发生中的作用。研究方法本课题以人胰腺癌组织标本作为实验材料，结合分子生物学、动物行为学和细胞钙离子成像等技术方法，关注肥大细胞及其脱颗粒产物组胺、类胰蛋白酶和NGF的表达变化及其对TRPV1的作用，分别进行了以下研究：1．采集胰腺肿瘤手术标本行组织学检查、肥大细胞计数及其在肿瘤中分布的主要部位。2．通过ELISA方法行胰腺肿瘤标本中肥大细胞脱颗粒产物组胺、类胰蛋白酶和NGF释放水平测定。3．行为学方法检测足底注射胰腺肿瘤组织孵育上清对野生型(wild-type, WT)及TRPV1基因敲除型(TRPV1-/-)小鼠的热痛与机械痛的作用。4．胰腺肿瘤孵育上清对小鼠背根神经节(Dorsal root ganglion, DRG)神经元TRPV1介导的钙离子内流变化的影响及其机制。研究结果1．组织标本H-E染色可见PC患者胰腺组织正常结构消失，由易行的肿瘤细胞取代，分化结构紊乱；甲苯胺蓝染色可见肿瘤组织周围肥大细胞数目相比正常胰腺组织有显著升高；Western blot结果显示肥大细胞更主要分布于肿瘤组织周围而非肿瘤内部。2．ELISA分别检测标本中组胺、类胰蛋白酶和NGF的释放水平，肿瘤组织相对于正常组织的都有显著升高。3．肿瘤组织孵育上清注射于WT小鼠足底后，相对于正常胰腺组织上清注射可显著降低小鼠热痛阈和机械痛阈值；而上述两种上清分别注射于TRPV1-/-小鼠时这一变化则无明显差异。4．在培养的WT小鼠DRG神经元上，辣椒素处理可导致部分细胞发生钙离子内流，胰腺肿瘤组织孵育上清预处理可引起辣椒素敏感的钙离子内流增加；弱酸环境(pH=6)可引起TRPV1激活而发生钙离子内流，而肿瘤孵育上清预孵育也可引起钙离子内流增加。结论研究结果表明，人胰腺肿瘤组织标本中的肥大细胞数目增多，特异性肥大细胞脱颗粒产物组胺和类胰蛋白酶表达增加，非特异性肥大细胞释放产物NGF表达亦增加，肿瘤组织离体孵育上清可在体激活小鼠躯体伤害性感受神经元，通过TRPV1受体引起伤害性感受行为学变化；该孵育上清作用于培养的DRG神经元时可引起钙离子内流变化，且该变化通过TRPV1发生，提示胰腺肿瘤孵育上清中来源于肥大细胞脱颗粒的不同产物，可能分别通过各自作用路径作用于TRPV1使其发生高敏进而参与伤害性感受神经元激活。因此，胰腺癌周围聚集激活的肥大细胞及其脱颗粒产物对TRPV1的作用可能在胰腺癌痛的发生与维持机制中发挥关键作用。